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tpldtc

金虫 (初入文坛)

估计是包涵体了,查一下包涵体蛋白纯化吧
11楼2011-07-19 11:01:23
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

增加样品和缓冲的盐浓度吧。
至少0.5M NaCl以上。
谁信谁知道。
生物资源交流QQ群:1044518333
12楼2011-07-19 11:33:12
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Suzhipeng

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

为什用PBS做镍柱平衡液呢?你破菌用的Buffer是PBS吗?
我一直在做His 标签的蛋白纯化,上清表达的蛋白在lysis,equilibrium,Binding所用的buffer是一样的都是含有10mM或20mM的咪唑buffer.
男怕入错行,女怕嫁错郎。
13楼2013-07-31 12:32:53
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soopyfu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by yanhui8558 at 2011-07-18 11:29:55
要活性的,且老师不想做变复性

问题解决了吗 我遇到了同样的问题
14楼2014-03-27 10:50:55
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yanhui8558

金虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by soopyfu at 2014-03-27 10:50:55
问题解决了吗 我遇到了同样的问题...

建议
1.检查基因的标签及附近序列有无问题
2.重新转化
3.增加盐浓度
4.更换填料
5.仔细看看填料的说明书。
15楼2014-03-28 08:04:25
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flll2014

铜虫 (小有名气)

建议看看你柱子的说明书,然后按照说明书缓冲液的配方做下试试
16楼2014-08-16 15:18:18
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永峰1230

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by Suzhipeng at 2013-07-31 12:32:53
为什用PBS做镍柱平衡液呢?你破菌用的Buffer是PBS吗?
我一直在做His 标签的蛋白纯化,上清表达的蛋白在lysis,equilibrium,Binding所用的buffer是一样的都是含有10mM或20mM的咪唑buffer.

破碎用PBS, 离心沉淀中 有包涵体,包涵体用盐酸胍溶解 NI柱纯化,不能挂住。。 这该怎么弄呢
12
17楼2015-01-30 10:49:50
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XMC-7

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by ybs007 at 2011-07-14 10:27:08
很有可能是你融合的蛋白改变了构象,将6His包裹起来不能与镍柱亲和。由于你用的是pET-21a,貌似只有C端的6His,所以要么更换载体,或者更换其他的纯化标签,比如T7标签。

较大可能,建议尝试更换载体
能帮的帮,难事求助的心情咱也经历过
18楼2015-09-08 17:00:35
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成事想心

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zx1984 at 2011-07-11 19:13:05
我用pet28a载体表达蛋白,也用超声破碎和和先溶菌酶处理后超声处理破碎,和你一样的情况,也是不挂镍柱。后来用wash buffer浓度梯度洗也不好。很郁闷。

老师,您好,我也用的是pet28a的载体,表达蛋白之后,裂解液也只能跑出一条带子,流出液也有,到洗脱液就洗不下来,更换了咪唑浓度50-500mM,缓冲液pH4.5-7.9.请问您现在这部分做出来了吗?求教求教。不胜感激
19楼2020-06-15 15:03:31
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