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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【原创经验篇】由一个简单的酶切重组载体想到的..........
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
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Originally posted by 天使托 at 2011-07-02 20:45:36:
活化是为了就是处理粘性末端。。。。
其实不活化也可以正常连接的。。。
我有时懒得活化照样可以进行连接的。。。。

我们从来不做活化的说……下次切不出来就试试先活化。
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11楼2011-07-02 21:12:41
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475502411

铜虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
谢谢天使君的慷慨共享，希望您实验顺利，给我们分享更多的东西
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
12楼2011-07-04 16:57:00
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friya0910

新虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-07-01 22:26:29:
不得不承认，有时候做实验确实运气有很大关系；前段时间，做啥出啥，那叫一个顺利呀。。。 可是最近，有些低迷，就拿很简单的一个双酶切，耽搁了偶2天时间，如果让小老板知道了，那完了，狂风暴雨一般呀。。 ...

目的片段今天送去测序，如果测序没问题的话马上也要做酶切连接了，楼主的帖子真及时啊，让我学到不少，以后有问题再请教楼主啊，希望到时不吝赐教哦！
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13楼2011-07-04 18:47:34
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erryzhen

禁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
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14楼2011-07-05 08:30:01
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yguang

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
酶切连接等都是分子生物学最基本的操作了，楼主总结的比较好也比较全，但在第3条“连接”中有点问题，就是最后：我的原则呢，基因比载体多些。这个是要看情况的，载体和基因片段的比例要视大小而定，在二者浓度基本相同的情况下，你的载体比片段大得多，当然体系中片段要比载体多了，如果你的载体和片段大小相当，二者的量也相当最好，如果载体比片段小的话，载体的量就要多一些了，也就是说小的要多加！
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15楼2011-07-05 10:08:30
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
Originally posted by yguang at 2011-07-05 10:08:30:
酶切连接等都是分子生物学最基本的操作了，楼主总结的比较好也比较全，但在第3条“连接”中有点问题，就是最后：我的原则呢，基因比载体多些。这个是要看情况的，载体和基因片段的比例要视大小而定，在二者浓度基 ...



很同意您的说法，这一点我确实考虑有些不妥。。。还是要看两者的浓度来定。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
16楼2011-07-05 10:13:11
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yguang

木虫 (职业作家)
★
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引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-07-05 10:13:11:


很同意您的说法，这一点我确实考虑有些不妥。。。还是要看两者的浓度来定。。。

不光是浓度，关键是大小，根据大小来调整所加的量！
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17楼2011-07-05 19:05:42
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+5): 很好的补充！ 2011-07-05 19:56:59
西瓜(EPI+1): 差点漏了 2011-07-05 19:58:58
“3：连接：连接之前呢，先将载体和基因混合，热活化一下，即45度10min，然后加连接酶，buffer，ddH2O；体系不用我说了，大家应该很清楚了，我的原则呢，基因比载体多些。。。”

“基因比载体多些”是个很笼统的表述，因为《基因克隆》上一向是建议外源片段比载体多的。这个多主要表现在量上，摩尔数，而不是分子量。例如载体3KB而外源片段1KB，那么当摩尔数相同时，跑胶后两条带的亮度是不同的，载体带比外源带亮约三倍，但它们的摩尔数是相同的，所以能下定论说它们的量是相同的。为了增加连接时候载体和外源片段相互碰撞连接成功的几率，外源片段和载体的摩尔数比例应该大于1，我喜欢用3。


“4：转化：转化前45度活化10min，然后转化进大肠杆菌感受态。。。涂布于加抗生素的板子上，这一步因载体不同，抗性标记也不同，筛选标记也不同，常见的就是蓝白斑筛选了，涂布X-gal少不了，过夜培养，一般18-24h,之后长出来的很少有对的。。。挑几个疑似连接上的单克隆划线第二天验证。。。”

蓝白斑筛选的时候选用的抗生素是氨苄青霉素，抗性基因为一个可以将抗生素内环切开导致抗生素失效的酶，所以培养时间长之后，阳性克隆的周围抗生素浓度下降，原本被抗生素抑制的大肠杆菌就能长出来，构成假阳性。因为这种菌是后来才长出来的，所以会比阳性克隆长得小，又因为主要是在阳性克隆旁边长出来的，所以叫做卫星菌落。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
18楼2011-07-05 19:30:26
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-05 19:30:26:
“3：连接：连接之前呢，先将载体和基因混合，热活化一下，即45度10min，然后加连接酶，buffer，ddH2O；体系不用我说了，大家应该很清楚了，我的原则呢，基因比载体多些。。。”

“基因比载体多些”是个很笼统 ...

很感谢您的补充。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
19楼2011-07-06 09:18:51
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星之砂

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
LL的分析好具体啊，我现在也在做连接，待连接基因大概3Kb多，可是都连不上去，望指点迷津啊啊
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每天的充实总好过发呆打诨一辈子
20楼2011-07-06 09:32:21
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