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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 如何用熔点法测定G+C mol%含量？
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aloon111

金虫 (正式写手)

[求助] 如何用熔点法测定G+C mol%含量？

如何用熔点法测定G+C mol%含量？所用的DNA是总DNA还是16s rDNA?
每一温度处理多少时间？用普通的紫外可见分光光度计没可以吗？
测OD值时，温度下降会不会造成DNA复性影响测量结果？
有没有具体的操作步骤？
谢谢。
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汇天下之贤
1楼 2011-06-22 16:35:28
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duckula7708

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

Marmur, J. & Doty, P. (1962). Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature. J Mol Biol 5, 109-118.
一般可以用热变性发测定，也可以用HPLC测定，得自己好好看下书。
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2楼2011-06-23 01:50:14
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aloon111

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by duckula7708 at 2011-06-23 01:50:14:
Marmur, J. & Doty, P. (1962). Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature. J Mol Biol 5, 109-118.
一般可以用热变性发测定，也可以用H ...

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汇天下之贤
3楼2011-06-23 09:05:23
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802311820

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

aloon111(金币+2): 谢谢了 2011-06-29 17:34:28
aloon111(金币+2): 2011-06-30 15:53:45
引用回帖:
Originally posted by aloon111 at 2011-06-22 16:35:28:
如何用熔点法测定G+C mol%含量？所用的DNA是总DNA还是16s rDNA?
每一温度处理多少时间？用普通的紫外可见分光光度计没可以吗？
测OD值时，温度下降会不会造成DNA复性影响测量结果？
有没有具体的操作步骤？
谢 ...

熔点法应该就是热变性温度测定法(Tm法)吧。
1. 所用DNA是基因组DNA，且无RNA污染，用紫外分光光度法测定纯度，天然DNA在260、230、280nm处的比值为：OD230:260:280=0.454:1:0.515，并结合琼脂糖凝胶电泳检测。DNA含量测定使用紫外分光光度法。
2.按照每分钟升温1℃的速度设置升温程序即可。
3.普通的紫外分光光度计没有加热系统测不了，现在有专门测G+Cmol%的仪器，比普通的紫外分光光度计多了加热系统和温度记录系统，可以设置升温程序。
4.测OD值时，温度下降，如果是在低温还没有开始解链的过程，是不会造成DNA复性的；如果已经开始解链，温度下降肯定会造成DNA复性，肯定会影响测量结果。
5.具体步骤（这《微生物学实验技术》上的，可行）：
（1）DNA提取 参照地衣芽胞杆菌染色体DNA提取方法，提取普通变形杆菌和E.coli K-12的DNA，并分别用0.1×SSC溶液溶解并稀释，使测定用DNA的最终浓度为A260nm=0.15~0.30，纯度为A260：A280：A230≥1：0.515：0.450。
（2）将带测菌株普通变形杆菌DNA的参比菌株E.coli K-12的DNA分别装入两只石英比色杯中，塞好带有晶体管点温度计热敏电阻探头的塞子，另一带塞子的石英比色杯装入0.1×SSC作空白对照。
（3）比色杯放入分光光度计的带有加热装置的比色架内，固定波长在260nm。
（4）迅速将比色杯内的温度上升到50℃左右，取出比色杯检查有无气泡，如有气泡用手指轻弹除去。
（5）设置测定程序 按照每分钟升温1℃的速度设置升温程序，具体的设置方法按仪器使用说明进行。
（6）测定终点判断 从50℃开始继续加热，同时记录变性曲线，当温度增加到A260吸收不再增加时即为测定终点。
（7）GC含量计算
在0.1×SSC溶液中，G+C mol%的计算公式为：
G+C mol%=51.2+2.08×（Tm（X）- Tm（R））
其中Tm（X）为待测菌Tm值，Tm（R）为E.coli K-12的的Tm值
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4楼2011-06-23 11:08:17
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