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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助啊！转质粒出现问题了！
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

[求助] 求助啊！转质粒出现问题了！

从公司买来了一段基因（3.7kb），那段基因是连在公司提供的质粒（2.7KB+3.7kb）上的，然后拿回来后就转入E.coli，然后就是扩增，提质粒，酶切跑电泳，切胶回收（3.7kb），再把那个基因连到我们实验室自己构建的载体（7.3kb）上，然后再做E.coli转化，但是很妖的事情发生了！！涂版以后，挑取长出来的单克隆，扩增，提质粒，酶切鉴定，得出的结果是3.7kb+2.7kb。。。做了好多好多遍都是这个结果，然后还用了菌落pcr鉴定那个质粒上的基因，结果是正确的。。这到底是怎么回事啊？求各位帮忙啊！！

师兄一开始认为我实验技能不过关，然后自己上来做，也是这个情况，其他博后过来指导，结果也是这个，这到底是怎么回事啊？去磷酸化也做过了，但还是这个情况。。。
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好好学习，天天向上！
1楼 2011-05-29 17:23:58
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2011-05-30 04:59:22:
超螺旋的速度可不是按规矩来的

你的没有切开的部分质粒是可以存在于你的大片段里的

你的对照做了吗

有没有直接把你回收的3.7kb片段做转化？有没有把你的3.7kb片段做一个自连，然后做转化？如果这个没 ...

对照组都做了，对照结果都是正常的。。。还有就是，切了很久，而且酶量也是相对于质粒的量要多的，还有就是用这个切下来的片段做别的另外几个片段连接，都得到想要的转化子了，还有就是另外两个博后也做了两遍，也是相同的结果，还有就是多谢批评！
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好好学习，天天向上！
13楼2011-06-03 21:01:38
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

把2.7kb的测序吧。。。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2011-05-29 19:47:03
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lw582482481

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

萝卜丝儿(金币+1): 2011-06-05 15:11:06
你这个只能说明一个问题，实验污染了。
1.  首先是你构建的第一个质粒i，在酶切胶回收片段不纯，混有没有切干净的质粒或者载体片段，这都有可能。因为片段差距不是很大
2. 你们的第二个载体很大本身连接不是很好长克隆。

改进的方法就是你把第一个载体换一下，换成一个和你的目的片段大小差距较大的载体。
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30而立
3楼2011-05-29 20:54:38
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)
silicare: why 2011-05-30 11:53:09
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2011-05-29 12:47:03:
把2.7kb的测序吧。。。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

我很早就跟师兄说了，但是貌似他不肯去测序。。。
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好好学习，天天向上！
4楼2011-05-30 04:06:29
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