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yanfeier

金虫 (小有名气)

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Originally posted by IMB2009 at 2011-05-30 00:18:10:
诱导后低温大概20度试试

低温？

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11楼2011-05-30 09:13:04

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yanfeier

金虫 (小有名气)

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Originally posted by lly198784 at 2011-05-29 15:48:56:
表达载体针对你的宿主菌是表达的吗？有文献报道吗？诱导剂加入的时间及诱导剂浓度以及诱导时间很重要的哦！

是有文献报道的，我才首先选这个载体的。我们是在OD在0.6-0.8之间诱导的，1mM的浓度，诱导过夜的

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12楼2011-05-30 09:15:25

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lly198784

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

有些酶是需要低温诱导的，防止包涵体的形成，另外大肠杆菌的话一般加入诱导剂后诱导6-8小时。

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13楼2011-05-30 11:06:57

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deblway

铜虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 欢迎继续交流 2011-05-30 12:47:00
yanfeier(金币+4): 2011-05-30 14:32:53

说下我的看法吧。。。首先，蛋白不表达的情况很容易出现！并不是说你转进去了一诱导就表达了。。根据楼主说的情况有些问题还是不是很清楚。。比如插入片段的大小，是一种什么物质，采用何种表达方式，融合表达还是什么其他方式等等。。过小的插入片段表达起来是有些问题的，很容易自身就降解掉。。看不到或者量很少是正常的。。如表达产物如果对宿主菌有毒害作用的话，刚刚表达就对宿主有破坏作用，诱导再长时间也是一样。融合表达的话你采用的是HIS tag还是GST等都是关键问题，一般来说单纯的HIS标签虽然会很容易纯化，但无法切除会对后期有影响！GST标签融合的不但会方便纯化而且会防止内部菌体蛋白的降解作用，特别是针对较小的蛋白十分有效，当然了也有很多是为了增加可溶性以及表达量的泛素类分子伴侣作为标签的！另外，如果你插入基因的来源是真核，是否有所用的宿主菌所不偏好的密码子？这个是需要在表达前就需要确定的，一般来说是不会有的，但也不排除有些片段中会有这种情况，如果此种情况的出现也会影响翻译的过程，在宿主菌种的翻译时会不识别相应的密码子，也会影响蛋白的表达情况!或者说不表达或表达量极低检测不到！还有就是有些宿主菌是无法合成一些稀有氨基酸的，而最悲剧的情况是你的插入片段当中恰恰有，就需要更换具有辅助质粒的宿主菌！另外，是否检测了总的菌体蛋白，不是单单的上清液。。。如果成为包涵体的话在你破碎后均在沉淀当中，可能不会收集！如果是包涵体形式的话，可以考虑诱导条件的改变，如降低诱导温度，降低IPTG浓度，降低培养转数等等，可以小样实验！当然也可以与一些分子伴侣进行融合表达，效果会更好些！以我的经验来说，如果确定了导入序列正确的前提下。。不表达是不太可能的，多多少少会有些许表达，只不过是可溶或不可溶。。降解了或未被降解。。或者说有些稀有氨基酸宿主菌中没有。。或者说插入片段有宿主菌不识别或不偏好的密码子。。插入片段对宿主有毒性。。如果碰到以上情况可能会麻烦点。。。总体上来说就是表达量多或少的问题。。表达本身是一个很宽泛的内容，涉及的内容非常多。。建议是用同一个载体或多个载体分别连接（当然条件允许的情况下）分别转入不同的常用宿主菌当中。。去验证表达情况。。文献当中的内容是可以参考的，但是我从来没有按照文献表达部分内容做出过相应产物。。。毕竟有一些东西他也是不公开的。。。rosetta菌可以一试！很容易购买！看看效果。。。说的乱了些！希望帮到你。。。算是抛砖引玉吧！最后祝你试验顺利！

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海贼王！哥当定了。。。。

14楼2011-05-30 11:38:03

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yanfeier

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Originally posted by deblway at 2011-05-30 11:38:03:
说下我的看法吧。。。首先，蛋白不表达的情况很容易出现！并不是说你转进去了一诱导就表达了。。根据楼主说的情况有些问题还是不是很清楚。。比如插入片段的大小，是一种什么物质，采用何种表达方式，融合表达还是 ...

谢谢我在调整一下实验

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15楼2011-05-30 14:33:43

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