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Extraction of Total RNA and RT-PCR Total RNA was extracted from lung and liver tissues (20mg) using RNeasy mini protection kit from QIAGEN according to the supplier·s guideline .The concentration and purity of the extracted RNA were checked spectrophotometrically by mea- suring 260/280 absorption ratios.The primer pair for ASTIV was designed in our laboratory using the Gene Fishe rprimer designing and Multialign-ment software.Usingtheforwardprimer(FP)5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3` /reverseprimer(RP)5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (GenBank acces- sion no.X52883),the299-bp AST IV cDNA was syn-thesized.The 264-bp STa cDNA was synthesized using the primer pair FP 5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG- 3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (GenBank accession no.M33329).The specificity of all primers was tested using the BLAST from the National Cen-terfo rBiotechnology Information Open Reading Frame software.cDNA synthesis from total 1 ug of liverand 2 ug of lung RNA was performed in a 50 uL reaction mixture.Concentrations of the different ingredients used followed the supplier·s guidelines. Forinterna control,500-bp cDNA of rat β-actin was synthesized from the same amount of RNA from respective sources. The prime rpair FP5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3` for the synthesis of rat β-actin cDNA was designed in our laboratory using the software mentioned above. |
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liqi9673
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【答案】应助回帖
wenjie(金币+3): 可以 2011-05-21 14:28:17
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总RNA的提取和逆转录聚合酶链反应技术 根据供应商的试剂盒上面的要求，使用RNeasy迷你保护组件，从肺和肝脏组织(20mg)中提取总RNA。通过测量吸收系数260/280来检测提取RNA的纯度和浓度。在实验室里，我们使用这个GF设计和Multialign-ment软件对ASTIV引物进行设计。使用正向引物（FP）5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3`/反向引物 (RP) 5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (基因编号：X52883)，来合成299-bp AST IV cDNA。运用正向引物5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG- 3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (基因编号：M33329)，来合成 264-bp STa cDNA 。使用国家生物信息公开阅读框架软件 BLAST 测试所有引物的特性。将总量1ug肝脏的互补DNA和2ug肺的RNA混合为50 uL，进行反应。根据供应商的要求使用不同材料的浓聚物。质控方面，以各自来源的相同数量的RNA合成大鼠β-肌动蛋白500-bp的cDNA。在实验室使用上面提到的软件，通过对引物FP 5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP 5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3`进行设计，合成大鼠β-肌动蛋白 cDNA。 |
4楼2011-05-19 10:20:08
8814402
至尊木虫 (职业作家)
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【答案】应助回帖
★
sltmac(金币+1): 谢谢交流~~ 2011-05-19 08:03:03
sltmac(金币+1): 谢谢交流~~ 2011-05-19 08:03:03
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总RNA的提取和RT-PCR 使用QIAGEN 的RNeasy mini protection 试剂盒，从20mg肺和肝组织提取总RNA。提取的RNA的难度和纯度通过分光光度计测定260/280nm吸收度的比值加以确定。引物由本实验室使用Gene Fisher 引物设计和多重校正软件设计。使用正向引物（FP）5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3` / 反向引物 (RP) 5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (GenBank获取编号：X52883),合成了299-bp 的AST IV cDNA。264-bp的 STa cDNA 通过使用如下引物对合成： FP 5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG- 3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (GenBank获取编号：M33329)。引物特异性通过国家生物信息技术中心的开放阅读框软件的BLAST测试。cDNA 的合成由总共1 ug的肝RNA和2 ug 的肺 RNA 在50 uL反应混合物中进行。各种试剂按照供应商的指定浓度加入。作为质控，以相同数量相应来源的RNA合成了500-bp的大鼠β-肌动蛋白cDNA。合成β-肌动蛋白 cDNA的引物对FP 5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP 5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3`有本实验室以前述软件设计。 |
2楼2011-05-19 08:00:16
8814402
至尊木虫 (职业作家)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
wenjie(金币+5, 翻译EPI+1): 可以 2011-05-21 14:27:12
sltmac(金币+5): 金币是给的太少了~~~ 2011-05-27 09:44:30
wenjie(金币+5, 翻译EPI+1): 可以 2011-05-21 14:27:12
sltmac(金币+5): 金币是给的太少了~~~ 2011-05-27 09:44:30
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总RNA的提取和RT-PCR 使用QIAGEN 的RNeasy mini protection 试剂盒，从20mg肺和肝组织提取总RNA。提取的RNA的浓度和纯度通过分光光度计测定260/280nm吸收度的比值加以确定。引物由本实验室使用Gene Fisher 引物设计和多重校正软件设计。使用正向引物（FP）5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3` / 反向引物 (RP) 5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (GenBank获取编号：X52883),合成了299-bp 的AST IV cDNA。264-bp的 STa cDNA 通过使用如下引物对合成： FP 5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG- 3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (GenBank获取编号：M33329)。引物特异性通过国家生物信息技术中心的开放阅读框软件的BLAST测试。cDNA 的合成由总共1 ug的肝RNA和2 ug 的肺 RNA 在50 uL反应混合物中进行。各种试剂按照供应商的指定浓度加入。作为质控，以相同数量相应来源的RNA合成了500-bp的大鼠β-肌动蛋白cDNA。合成β-肌动蛋白 cDNA的引物对FP 5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP 5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3`由本实验室用前述软件设计。 |
3楼2011-05-19 09:25:58
8814402
至尊木虫 (职业作家)
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5楼2011-05-23 07:49:31
