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biofind

新虫 (小有名气)

[交流] 自杀质粒

一般用于基因突变。
将突变的目的基因克隆到自杀性质粒载体上，通过接合等使其进入宿主，由于在宿主菌中不存在复制基因启始所需的复制蛋白（如Pi蛋白等），其无法复制，在外界选择性压力的作用下,自杀性质粒载体所携带的突变基因就与宿主染色体上的野生型发生基因发生二次同源重组，产生了带有突变的突变株；
而质粒载体自身由于自杀性特性连同染色体上原有的野生型基因一起随着细菌的传代从菌体内消失。
至于一次重组的突变株，可借助质粒上的某些选择基因（如sacB，sucrose敏感）筛除。

这是“自杀质粒”的一些原理性的问题，根据以上我想到了，在用自杀质粒实现突变的过程中，会有以下几种中间产物的形成：
野生型毒株（需要突变的原始染色体）
一次同源重组的突变株
二次同源重组的突变株
质粒载体本身（随着自杀质粒本身的特性，而在宿主菌中消失）
同源重组后含有野生型基因组的重组质粒（也随着自杀质粒的特性，在宿主菌中消失）

我的问题是，野生型的毒株是如何消失的？第一次同源重组与第二次同源重组的原理是什么？
谢谢
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1楼 2011-05-16 10:31:03
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wolfebst(金币+3, EPI+1): 奖励一下 2011-05-18 15:34:50
野生型的毒株是如何消失的？
答：这个要看你基因敲除是给基因中间插入的是什么片段了，如果是一段带有抗生素的片段，那么在筛选突变体的过程中我可以加入大量的该抗生素，导致野生型菌株死去，而带有抗生素片段的敲除基因（已经重组至染色体上）则会生存。

第一次同源重组与第二次同源重组的原理是什么？

一次重组就是带有敲除基因的片段和正常基因的片段都在染色体上；而二次重组完全就是将目的基因敲除后整合至染色体上了，如果一般达到一次重组了，继续在抗生素的板子上筛选和进行PCR验证就可以最终得到突变体了！
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7楼2011-05-18 15:27:30
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zier1011

木虫 (著名写手)
★
biofind(金币+1):谢谢参与
野生型的毒株是如何消失的？——随着自杀性质粒的转入，野生型毒株在严格意义上就不存在了，因为此时的菌株中含有质粒（质粒尚未在传代中丢失）。
我倒是和纳闷质粒所携带的基因什么情况下会跟宿主基因组基因发生重组？
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2楼2011-05-16 14:35:15
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biofind

新虫 (小有名气)
为什么野生型毒株在严格意义上就不存在了，你解释的原因我不是很明白。
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3楼2011-05-16 15:41:26
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biofind

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by biofind at 2011-05-16 10:31:03:
一般用于基因突变。
将突变的目的基因克隆到自杀性质粒载体上，通过接合等使其进入宿主，由于在宿主菌中不存在复制基因启始所需的复制蛋白（如Pi蛋白等），其无法复制，在外界选择性压力的作用下,自杀性质粒载体 ...

为什么野生型毒株在严格意义上就不存在了，你解释的原因我不是很明白。
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4楼2011-05-16 15:42:07
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