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pumpkin236

铁虫 (小有名气)

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专业: 细胞增殖、生长与分化

[交流] 【求助】基因沉默已有2人参与

最近打算做细胞的基因敲除实验，昨天做了下预实验，心都凉了半截儿了
所以只有来求助强大的小木虫了
实验步骤如下：
① 以合适的密度接种细胞至6孔培养板，在转染的前一天换用含10％新生小牛血清而无双抗的DMEM高糖培养液进行培养。当细胞培养到40％融合时，换用无血清无双抗的DMEM高糖培养液培养并进行转染；
② 对于需要转染的每孔细胞，用250μl的DMEM无血清无双抗培养基来稀释5μl的Lipofectamine2000，并在室温下孵育5min；
③ 用250μl的DMEM无血清培养基来稀释5μl的siRNA引物（含siRNA引物的量为100pmol ，siRNA在培养基中最终浓度为50nM）；
④ 将稀释了的lipofectamine2000（步骤2）和稀释了的siRNA引物（步骤3）混合均匀，在在室温下孵育20min促使siRNA引物/lipofectamine2000混合物的形成；
⑤ 直接往每孔中加入siRNA引物/lipofectamine2000混合物500μl，补足无血清培无双抗培养基至2mL，并轻轻摇晃培养板使其混匀；
但6h以后我去观察细胞，发现细胞全死了。我怕无血清对细胞影响大，我还专门用2%血清无双抗的培养基来稀释SIRNA和lipofectamine2000。但是6h后细胞还是死了不少。。。。

求教大家，这是为什么。。我们实验室师兄的眼睛上皮细胞如上处理都不会出现死亡。。。。

大家遇到过如上问题木有？？？

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