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1楼 2011-04-10 22:42:10

已阅关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

ujsyangyong

铁杆木虫 (著名写手)

MedEPI: 9
应助: 157 (高中生)
金币: 12087.9
红花: 6
帖子: 1002
在线: 134.7小时
虫号: 471632
注册: 2007-12-02
性别: GG
专业: 脑、脊髓、周围神经损伤及

想做什么指标呢？

★ ★ ★ ★ ★
winzhouyun(金币+5, EPI+1): 谢谢参与辛苦了！欢迎常来医学版 2011-04-12 13:16:30

最重要的要看你需要进行什么因子染色标记了，最重要的就是一抗，二抗还有DAB
在动物灌注固定切片染色过程中所需溶液：
4%多聚甲醛：A液：称取40g多聚甲醛干粉，加入400ml dd H2O中，滴加少许1mol/l NaOH溶液，密封置60℃水浴，使其完全溶解。B液：称取16.88g NaH2PO4•2H2O加入300ml dd H2O中，使其完全溶解。C液：称取3.86g NaOH加入200ml dd H2O中，使其完全溶解。将ABC液混匀，调节pH值为7.2-7.4，定容至1000ml。4℃储存备用，两周内使用。
磷酸盐缓冲液（PBS）：8g Nacl, 0.2g KCl, 1.56g Na2HPO4.H2O, 0.2gKH2PO4 溶解于 1L dd H2O 中。
70%、75%、80%、85%、90%、95%、梯度酒精溶液按照体积比用ddH2O稀释。
苏木素染液：将苏木素 2g溶于100ml无水酒精中，硫酸铝钾 15g溶于100ml蒸馏水中，与100ml甘油、10ml冰醋酸加在一起，充分搅拌均匀后，日晒四周，让其慢慢氧化成熟后方可使用。
伊红染液：水溶性伊红 2.5g 用蒸馏水(少许)调成浆糊状，加入70-75%酒精　　　　250ml边加边搅拌，直到彻底溶解，此时试剂有些混浊，取少许冰醋酸，加入到试剂中去，试剂逐渐转变为清亮，呈鲜红色。
1%HCl酒精：向250ml 70%酒精中按（1:100）体积比加入2.5ml浓盐酸，混匀。
大概步骤：
动物麻醉后心脏灌注多聚甲醛固定，取肝脏后固定，石蜡包埋并切片或者冰冻切片。石蜡切片，片厚2μm。漂片水温50℃，烘片温度90℃。
石蜡切片脱蜡：
将石蜡切片装上片架，置60℃烘箱干烤1h至石蜡融化，趁热依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、80%乙醇、75%乙醇、70%乙醇、双蒸水中，每道5min。
抗原热修复（冰冻不需要）：
将脱水后的石蜡切片置于pH6.0的0.01M枸橼酸盐缓冲液槽中，水浴加热至100℃维持30min，待其自然冷却至室温。
免疫组织化学染色：
将经过抗原热修复的石蜡切片平铺在湿盒内，滴加甲醇稀释的3%过氧化氢溶液，室温放置30min灭活内源性过氧化物酶，PBS洗涤5min×3次，滴加3%BSA封闭非特异结合位点，室温放置30min，倒去多余BSA溶液，滴加以3%BSA溶液1:200稀释的第一抗体，4℃过夜，次日晨，取出，倒去多余抗体溶液，PBS洗涤5min×3次，滴加3%BSA溶液1:200稀释的第二抗体，37℃孵育1h，PBS洗涤5min×3次，滴加DAB显色剂，室温显色，随时观察，适时终止显色反应。每次实验均设置阳性对照及阴性对照组，阳性对照采用已知阳性切片，阴性对照采用PBS代替第一抗体。
苏木素复染细胞核：
将免疫组化染色完毕的切片置于苏木素染液中染色3-5min，立即取出，流水洗去多余苏木素染液，1%HCl酒精分化3s，置流水中蓝化45min。
脱水、透明、封片
将染色完毕的切片依次通过70%乙醇、75%乙醇、80%乙醇、85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ梯度酒精脱水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，中性树胶封片。
如不明白，请短我。

[ Last edited by ujsyangyong on 2011-4-11 at 22:58 ]