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humolon金虫 (正式写手)
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[交流]
一个不错的蛋白表达指南
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以一个蛋白的表达实验为例，告诉大家从拿到一个课题开始，如何一步步地分析蛋白、设计实验手段、分析实验结果、提出下一步实验计划给我们很多启示。 在每一步都提出好几个问题，引导你学会如何分析问题，这样的课件确实非常棒！ 总结一下：对于一个蛋白来说 第一步：了解该蛋白的基本信息，获得序列信息、了解Domain的构成情况。工具：Entrez、Interpro、CDD（补充：UniProt、GeneCards） 很有意思的是，在这里作者给出的判断题是This project is too complicated. Let's abandon it.而答案是：Right - a pesimist is an optimist with a lot of experience!! 第二步：对蛋白序列进行生物信息学分析。 1：是否含有稀有密码子。工具：Rare Codon Caltor（补充：GCUA） 2：是否有二硫键。工具：PredictProtein 3：是否含有信号肽。工具：SignalP, PsortII 4：磷酸化和糖基化位点。工具：Netphos, YinOYang , NetNGlyc, NetOGlyc 第三步：构建载体在不同的菌株中表达，同时尝试不同的诱导条件，包括：诱导时OD值、诱导温度、IPTG浓度、诱导时间。SDS－PAGE电泳及Western－Blot分析表达结果。同时进行细菌生长曲线作图，观察目的蛋白对宿主菌是否有毒害作用。 虽然最终的表达结果仍然不令人满意，但是通过这样的分析过程确实学到很多。 链接地址：http://teachline.ls.huji.ac.il/72682/RTS/HP.html |
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