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shajun
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【求助/交流】“将感受态细胞和DNA混合物冰浴30min”的作用是什么？已有7人参与
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求教各位前辈： 大肠杆菌化学转化法，其中有一个步骤：“将感受态细胞和DNA混合物冰浴30min”，请问各位，这个过程的作用是什么？ 目的是“使细胞和DNA充分混合吗”？ 如果是，请问只有实现了这个充分混合就可以吗，而不考虑时间的长度？比如1 s 就实现了充分混合，还需要再孵育吗？ 注释：微流控芯片技术可以实现两种液体的瞬间混合，比如0.1 s 。 补充：根据虫友“woshishao” 给我的三个假说，其在说明一个问题，就是这个30min的孵育过程是为了让DNA和细胞上的LPS结合，这样，在随后的热激促使细胞吞下DNA-LPS复合物（this incubation was equivalent to the time of DNA adsorption to the competent cells）。 但是这不是我想要的答案，我的问题是：DNA结合到细胞上为什么需要这么久？其原因是不是因为DNA扩散到细胞表面需要这么久？ 因为我们知道，如果DNA和细胞足够近的话，其结合（相当于化学反应）是相对快的，可以说是瞬间完成。当然对于这一点，也是我的猜测，根据是免疫分析也是大分子反应，孵育过程长（2h），这个过程就是一个扩散过程；而当在微流控芯片上完成这个过程时，就需要5s，因为微流控芯片上的快速混合。 因此我据此猜想，DNA与细胞的这个30min的孵育过程也是为两者的扩散接触；如果能够在0.1s内实现这个过程的话，其形成DNA-LPS复合物的过程就可以在0.1s内完成。 请各位学者专家拍砖！ [ Last edited by shajun on 2011-3-3 at 20:18 ] |
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2楼2011-03-03 17:51:27
woshishao
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现在貌似还只有假说解释
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给你几个假说： 1.半个小时冰浴，是为了让加入的质粒与细胞表面的脂多糖发生结合，从而粘附在细胞表面。从而在热激后进入细胞。 参考文献： Mechanism of artificial transformation of E. coli with plasmid DNA: Clues from the influence of ethanol SARKAR Suchitra ; CHAUDHURI Sujan ; BASU Tarakdas 2.Ca能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面 来源：网络，具体忘记了 3.One proposed hypothesis is that DNA crosses through the least-barrier path at zones of adhesion, where the outer and inner cell membranes fuse to pores in the cell wall. The zones of adhesion are rich in negatively-charged lipo polysaccharide (LPS) molecules and DNA also being negatively charged, cannot enter the cell easily as the two negative polarities repel each other. A divalent cation such as calcium, is believed to form stable coordination complexes with phosphates, and thus may facilitate the association of the two phosphate-rich structures like DNA and LPS. 参考文献： DNA Science: A First Course in Recombinant DNA Technology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990, pp. 26–29. 最后一种假说，我偷懒，楼主自己翻译下吧。  |
3楼2011-03-03 18:16:59
brightfuture01
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以上假说在说明一个问题，就是这个30min的孵育过程是为了让DNA和细胞上的LPS结合，这样，在随后的热激促使细胞吞下DNA-LPS复合物（this incubation was equivalent to the time of DNA adsorption to the competent cells）。 但是这不是我想要的答案，我的问题是：DNA结合到细胞上为什么需要这么久？其原因是不是因为DNA扩散到细胞表面需要这么久？ 因为我们知道，如果DNA和细胞足够近的话，其结合（相当于化学反应）是相对快的，可以说是瞬间完成。当然对于这一点，也是我的猜测，根据是免疫分析也是大分子反应，孵育过程长（2h），这个过程就是一个扩散过程；而当在微流控芯片上完成这个过程时，就需要5s，因为微流控芯片上的快速混合。 因此我据此猜想，DNA与细胞的这个30min的孵育过程也是为两者的扩散接触；如果能够在0.1s内实现这个过程的话，其形成DNA-LPS复合物的过程就可以在0.1s内完成。 请各位学者专家拍砖！ |
7楼2011-03-03 20:16:29
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