应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有谁知道DDRT-PCR吗
51/1返回列表
查看: 634  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

» 本帖附件资源列表

  • 欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
    本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com
  • 附件 1 : 1.jpg
    • 2006-07-18 14:00:17, 58.1 K
  • 附件 2 : 2.jpg
    • 2006-07-18 14:00:17, 21.47 K
楼1970-01-01 08:00:00
已阅   申请BioEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

hwchen2000

金虫 (正式写手)
非常谢谢songjiyuan的解释
赞一下 回复此楼
4楼2006-07-19 10:34:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

songjiyuan

银虫 (正式写手)

传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）和第二代差异显示系统

★ ★
dfggc(金币+2):谢谢支持
传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）和第二代差异显示系统
真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的分化、凋亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。高等生物大约有30 000个不同的基因，但在生物体内任意细胞中只有10%的基因得以表达，而这些基因的表达是按事件和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。其包括新出现的基因表达与表达量有差异的基因表达。生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差异表达引起的。由于基因差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。
研究基因差异表达的主要技术有差别杂交（筛选）（differential hybridization）、扣除（消减）杂交（subtractive hybridization of cDNA， SHD）、mRNA差异显示（mRNA differential display， DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization， SSH）、代表性差异分析（represential display analysis， RDA）、交互扣除ＲＮＡ差别显示技术（reciprocal subtraction differential RNA display）以及基因表达系列（serial analysis of gene expression， SAGE）分析和电子消减（electronic subtraction）和DNA微列阵分析（DNA microarray）等。
这里我们重点介绍传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）和第二代差异显示系统：限制性酶切片段差异显示（RFDD-PCR）

传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5'-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。
原理见下图1：


虽然mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）具有很多优点:1)速度快,较易操作;2)由于PCR扩增技术的应用,使得低丰度mRNA的鉴定成为可能,且灵敏度高;3)可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。但在实际操作中仍存在一些问题,主要表现在:
1)出现差别条带太多,假阳性率高达70%左右,重复性差,且对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性;
2）在有差异的显示片段中难以知道哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因
3)得到的有差异的扩增条带短,一般在110～450bp之间；
4）以poly(A)为引物的PCR扩增只适合真核生物。
所以差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。第二代差异显示系统:限制性酶切片段差异显示（RFDD-PCR）就是一个很有效的改进。
RFDD-PCR不是直接扩增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切后的cDNA片段两边加上特殊接头进行扩增。正是RFDD-PCR系统使用了一系列特殊接头和引物，特异性PCR引物的使用和下游的PCR反应使RFDD-PCR分析具有高度的重复性，解决了第一代差别显示系统的重复性问题；因为RFDD-PCR技术不使用以poly(A)为引物的PCR扩增，因而该系统对原核和真核系统皆适用；在第一代的差异显示系统中，下游引物特异性结合poly(A)尾，因此与3'端未翻译区域相对应的差异表达序列大部分被鉴别出，而RFDD-PCR 采用优先切割翻译序列的限制性内切酶（如TaqI），因此可以优先展示编码区，更加适合于下游功能分析；使用RFDD-PCR或得差异显示基因后，与disploy Fit网络相连后，可以确定哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因，对下一步研究有很好的知道意义。总之，RFDD-PCR中高度严谨的PCR可以产生结果一致的基因表达图谱，重点放大和展示编码区，对原核及真核RNA都有用，大大消除假阳性。原理见下图2:
赞一下(5人) 回复此楼
2楼2006-07-18 14:00:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

81332070

俺们基因工程的试题就有这个
赞一下 回复此楼
5楼2006-07-19 15:12:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

davidstone

捐助贵宾 (著名写手)

0.5

值得鼓励。。。
回复此楼
6楼2006-07-19 17:45:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +15 爱看书的可乐 2026-08-26 17/850 2026-08-28 01:23 by xxniao123
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+5) +11 晴天加油 2026-08-26 12/600 2026-08-28 01:22 by li09465290@
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 XLGfUIdOmEAO 2026-08-27 4/200 2026-08-27 22:26 by 3RAFyYXYSwGS
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +7 苏东坡二世 2026-08-23 7/350 2026-08-27 18:14 by 瞬息宇宙
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 系统查不到 +10 董八千 2026-08-26 10/500 2026-08-26 16:30 by Equinoxhua
[基金申请] 怎么查啊 +5 huang1991js 2026-08-26 5/250 2026-08-26 16:09 by Equinoxhua
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +9 炎黄贵胄 2026-08-22 10/500 2026-08-26 15:40 by semaglutide
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +22 羊腰板 2026-08-21 25/1250 2026-08-26 15:00 by zuocuiping
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 人气不行了 +11 fansofjerry 2026-08-21 11/550 2026-08-25 11:04 by 孤独的英雄6
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭