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hwchen2000金虫 (正式写手)
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有谁知道DDRT-PCR吗
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songjiyuan
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传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）和第二代差异显示系统
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传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）和第二代差异显示系统 真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的分化、凋亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。高等生物大约有30 000个不同的基因，但在生物体内任意细胞中只有10%的基因得以表达，而这些基因的表达是按事件和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。其包括新出现的基因表达与表达量有差异的基因表达。生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差异表达引起的。由于基因差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。 研究基因差异表达的主要技术有差别杂交（筛选）（differential hybridization）、扣除（消减）杂交（subtractive hybridization of cDNA， SHD）、mRNA差异显示（mRNA differential display， DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization， SSH）、代表性差异分析（represential display analysis， RDA）、交互扣除ＲＮＡ差别显示技术（reciprocal subtraction differential RNA display）以及基因表达系列（serial analysis of gene expression， SAGE）分析和电子消减（electronic subtraction）和DNA微列阵分析（DNA microarray）等。 这里我们重点介绍传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）和第二代差异显示系统：限制性酶切片段差异显示（RFDD-PCR） 传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5'-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。 原理见下图1： 虽然mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）具有很多优点:1)速度快,较易操作;2)由于PCR扩增技术的应用,使得低丰度mRNA的鉴定成为可能,且灵敏度高;3)可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。但在实际操作中仍存在一些问题,主要表现在: 1)出现差别条带太多,假阳性率高达70%左右,重复性差,且对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性; 2）在有差异的显示片段中难以知道哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因 3)得到的有差异的扩增条带短,一般在110～450bp之间； 4）以poly(A)为引物的PCR扩增只适合真核生物。 所以差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。第二代差异显示系统:限制性酶切片段差异显示（RFDD-PCR）就是一个很有效的改进。 RFDD-PCR不是直接扩增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切后的cDNA片段两边加上特殊接头进行扩增。正是RFDD-PCR系统使用了一系列特殊接头和引物，特异性PCR引物的使用和下游的PCR反应使RFDD-PCR分析具有高度的重复性，解决了第一代差别显示系统的重复性问题；因为RFDD-PCR技术不使用以poly(A)为引物的PCR扩增，因而该系统对原核和真核系统皆适用；在第一代的差异显示系统中，下游引物特异性结合poly(A)尾，因此与3'端未翻译区域相对应的差异表达序列大部分被鉴别出，而RFDD-PCR 采用优先切割翻译序列的限制性内切酶（如TaqI），因此可以优先展示编码区，更加适合于下游功能分析；使用RFDD-PCR或得差异显示基因后，与disploy Fit网络相连后，可以确定哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因，对下一步研究有很好的知道意义。总之，RFDD-PCR中高度严谨的PCR可以产生结果一致的基因表达图谱，重点放大和展示编码区，对原核及真核RNA都有用，大大消除假阳性。原理见下图2: |
2楼2006-07-18 14:00:17
3楼2006-07-18 14:37:37
hwchen2000
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davidstone
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