24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 3054  |  回复: 14

adslye

银虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by gundamba at 2010-12-21 15:36:39:

我是这样,做完转化,挑40管单菌落进行验证...

请问你是如何验证的?PCR还是酶切~~
通过分子量初步判定吗?那还是可能出现楼主的情况,片段大小差不多,但内容可能改变。
11楼2010-12-22 11:25:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gundamba

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2010-12-22 11:25:38:


请问你是如何验证的?PCR还是酶切~~
通过分子量初步判定吗?那还是可能出现楼主的情况,片段大小差不多,但内容可能改变。

我还是根据分子量初步判断,后来发现有比远质粒大的质粒,然后精提,酶切验证...因为我是单酶切连接,所以还要验证方向性。
12楼2010-12-23 08:50:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

adslye

银虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by gundamba at 2010-12-23 08:50:33:

我还是根据分子量初步判断,后来发现有比远质粒大的质粒,然后精提,酶切验证...因为我是单酶切连接,所以还要验证方向性。

哦,不过40管一批。。。。好多好累~~~~
我偷懒做菌落PCR,大批量都很累。。。。

哎~细菌会说话就好了,以后工程菌就应该向人性化方面发展!!
呵呵~
13楼2010-12-23 09:26:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lv34257740

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
深有同感啊,我遇到的情况跟你的一模一样,可是到现在都没搞清楚是啥原因,我都不知道那质粒还能不能用啦
14楼2011-04-22 16:47:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-04-23 14:51:54
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-12-13 09:50:44:
各位虫友,我想请教一下,你们有没有遇到质粒转到感受态细胞后,会丢失片段的问题?
我最近遇到了一个问题,就是将质粒切开,人工插入一个片段,再连接后,转化到感受态细胞中,结果得到的新的质粒丢失了一个很大 ...

1. 结果得到的新的质粒丢失了一个很大的片段。你的酶切位点没问题吧,比如该质粒其他位置还有这个酶的位点,你核实了没?
2. 原质粒的菌体通过没有抗性的LB培养基传代培养,从而筛选一个完全丢失质粒的受体菌。 原则上讲,这个方法是有漏洞的,虽然带质粒的E.coli分裂时间长,但是还是会生长呀,最后就有可能会出现你说的那种情况,提出来的质粒,发现有2条带...
不过最好上图,看了图就可以具体问题具体分析了,我这也只能凭你说的瞎猜猜。
生活是美好的
15楼2011-04-23 13:54:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wangdandelia 的主题更新
普通表情 高级回复(可上传附件)
信息提示
请填处理意见