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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒片段丢失问题
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adslye

银虫 (正式写手)
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Originally posted by gundamba at 2010-12-21 15:36:39:

我是这样，做完转化，挑40管单菌落进行验证...

请问你是如何验证的？PCR还是酶切~~
通过分子量初步判定吗？那还是可能出现楼主的情况，片段大小差不多，但内容可能改变。
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11楼2010-12-22 11:25:38
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gundamba

木虫 (小有名气)
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Originally posted by adslye at 2010-12-22 11:25:38:


请问你是如何验证的？PCR还是酶切~~
通过分子量初步判定吗？那还是可能出现楼主的情况，片段大小差不多，但内容可能改变。

我还是根据分子量初步判断，后来发现有比远质粒大的质粒，然后精提，酶切验证...因为我是单酶切连接，所以还要验证方向性。
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12楼2010-12-23 08:50:33
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adslye

银虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by gundamba at 2010-12-23 08:50:33:

我还是根据分子量初步判断，后来发现有比远质粒大的质粒，然后精提，酶切验证...因为我是单酶切连接，所以还要验证方向性。

哦，不过40管一批。。。。好多好累~~~~
我偷懒做菌落PCR，大批量都很累。。。。

哎~细菌会说话就好了，以后工程菌就应该向人性化方面发展！！
呵呵~
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13楼2010-12-23 09:26:46
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lv34257740

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
深有同感啊，我遇到的情况跟你的一模一样，可是到现在都没搞清楚是啥原因，我都不知道那质粒还能不能用啦
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14楼2011-04-22 16:47:55
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)
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西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-04-23 14:51:54
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-12-13 09:50:44:
各位虫友，我想请教一下，你们有没有遇到质粒转到感受态细胞后，会丢失片段的问题？
我最近遇到了一个问题，就是将质粒切开，人工插入一个片段，再连接后，转化到感受态细胞中，结果得到的新的质粒丢失了一个很大 ...

1. 结果得到的新的质粒丢失了一个很大的片段。你的酶切位点没问题吧，比如该质粒其他位置还有这个酶的位点，你核实了没？
2. 原质粒的菌体通过没有抗性的LB培养基传代培养，从而筛选一个完全丢失质粒的受体菌。 原则上讲，这个方法是有漏洞的，虽然带质粒的E.coli分裂时间长，但是还是会生长呀，最后就有可能会出现你说的那种情况，提出来的质粒，发现有2条带...
不过最好上图，看了图就可以具体问题具体分析了，我这也只能凭你说的瞎猜猜。
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生活是美好的
15楼2011-04-23 13:54:25
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