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挥汗如雨

至尊木虫 (职业作家)

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[交流] 【求助】【求助/交流】TCA法提取蛋白最后溶解离心出现大量粘稠透明的胶状物质是什么原已有2人参与

近一次用TCA/丙酮法提取植物叶片总蛋白,在最后丙酮洗涤沉淀凉干、裂解液再溶解后离心取上清时，在上清和沉淀物之间出现大量粘稠透明的胶状物质，以前重来没有过这种情况。求助蛋白高手指点这是什么原因造成的？如何避免再出现类似情况？这些粘稠透明的胶状物质难道是难溶的蛋白？是由于这次操作沉淀凉干时间过长，造成蛋白不可逆变性聚集难溶？

下面是我这次提取具体过程：

TCA/丙酮法
（1）  将植物叶片样品 250 mg液氮研磨粉末重悬在1.5 ml TCA提取缓冲液中，-20℃放置过夜(以前做时是6小时)，蛋白会形成白色沉淀。
（2）  5000g，4℃离心15min。用Tip头小心吸取上清丢弃。
（3）  在沉淀中加入1.6 ml冰预冷的丙酮，5000g，4℃离心10min。用Tip头小心吸取上清丢弃。
（4）  重复步骤2-3次。
（5）  将沉淀晾干（这次感觉比以前晾干时间长），使用800 ul裂解液溶解沉淀。(由于实验做到这步已经半夜了，所以就放入-20℃过夜,第二天才做的下一步。以前做都是直接进行下一步)
（6）  40000g，4℃离心30min。取出上清，测定蛋白质浓度。（这步在上清和沉淀物之间出现大量粘稠透明的胶状物质，以前重来没有过这种情况）

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