【求助/交流】PCR产物电泳检测 - 分子生物 - 综合其他 - 第2页小木虫论坛-学术科研互动平台

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11楼2010-11-26 11:34:12

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piaoyuaaa

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Originally posted by 天使托 at 2010-11-26 11:33:24:

你是用基因组的DNA作为模板进行扩增吗？如果是的话就不需要对照了，只需要看扩增出来的目的基因的大小正确就行了！

恩，我是用基因组的DNA作为模板的，可是没有扩增出来，问题会出在哪里呢？

12楼2010-11-26 13:35:31

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piaoyuaaa

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Originally posted by wsc0451 at 2010-11-26 11:34:12:
十有八九就是根本没扩增出来了。。。当然最好还是做个阳性对照看下。。。

阳性对照怎么设计的呢？用什么做模板呢？

13楼2010-11-26 13:36:04

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aga0110125

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PCR的阳性对照就是PCR一定能扩出目的条带的反应体系
在你这里，就是一定包含你目的片段的DNA，如确定含有你目的片段的基因组DNA
PS：不要太相信参考文献所给的数据，至少在合成引物前，先拿引物序列去和目的片段吻合一下，确定是特异引物；收到引物后，也要对比Tm值，确认扩增程序

14楼2010-11-26 15:26:50

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piaoyuaaa

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Originally posted by aga0110125 at 2010-11-26 15:26:50:
PCR的阳性对照就是PCR一定能扩出目的条带的反应体系
在你这里，就是一定包含你目的片段的DNA，如确定含有你目的片段的基因组DNA
PS：不要太相信参考文献所给的数据，至少在合成引物前，先拿引物序列去和目的片段 ...

包含目的片段的DNA ？我做的是巢式PCR,第一轮扩800bp,第二轮扩230bp.现在的问题是第一轮800bp都没有扩出来，要是阳性对照扩出来的话是我的模板的问题，要是没有扩出来的话是体系和程序的问题，对吗？那个包含目的片段的DNA用含800bp的Marker？是新手，不太懂这方面的，谢谢指导

15楼2010-11-26 16:29:02

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chunbaobei69

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可以试试增加循环次数，或者调整体系试试！

16楼2010-11-26 16:47:06

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xudan667

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有没有加阳性对照？

17楼2010-11-26 17:11:08

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yinsongna

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你的模板是基因组，你同时扩一个内参基因做对照，如果内参基因也没有扩出来就是你的模板问题，如果内参基因扩出来了，你的目的条带没有的话，可能的问题就多了：1，PCR体系是否出错？2.退火温度是否合适？3.引物确定能用吗？你从什么文章上看来的？。。。。这年头学术造假太严重

18楼2010-11-26 19:55:35

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piaoyuaaa

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Originally posted by xudan667 at 2010-11-26 17:11:08:
有没有加阳性对照？

阳性对照怎么设计啊，怎么找到肯定包含目的片段的基因呢？我是新手，对这方面不懂哦。谢谢

19楼2010-11-28 17:24:15

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yuer9809

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楼主的理论知识太差了，连阳性对照和阴性对照都没搞明白是什么东西。PCR做不出来不是很正常吗？看楼主准备坐DGGE估计是环境样品的基因组了，不是土壤就是水体或粪便污泥什么的。我估计楼主连模板纯不纯都不知道。楼主能不能先好好补充下这方面的知识？