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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题
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adslye

银虫 (正式写手)
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Originally posted by lhwei1987 at 2010-11-21 09:44:45:

我也经常扩出两边相同引物的条带，而且都和目的条带差不多，很悲剧，现在我都加上左右单引物对照，费点事，放点心

用热不对称PCR可以缓解这种现象不？不用随即引物，就是一对引物的退火给它有个差别，然后用热不对称的步骤P。 我现在就是烦这个，我设计的特异性引物不工作，总是另一条单引物起作用。我是酶切产物两边加上接头。用自己的引物和接头引物做巢扩。结果总是smear。
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11楼2010-11-21 09:52:17
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
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Originally posted by adslye at 2010-11-21 09:52:17:


用热不对称PCR可以缓解这种现象不？不用随即引物，就是一对引物的退火给它有个差别，然后用热不对称的步骤P。 我现在就是烦这个，我设计的特异性引物不工作，总是另一条单引物起作用。我是酶切产物两边加上接 ...

我觉着TAIL体系条件也并不是很好把握；接头为什么两边加呢，那岂不是第一步特异性很差
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12楼2010-11-21 10:51:32
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adslye

银虫 (正式写手)
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lstt09nk(金币+2):鼓励交流 2010-11-26 09:37:23
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Originally posted by lhwei1987 at 2010-11-21 10:51:32:

我觉着TAIL体系条件也并不是很好把握；接头为什么两边加呢，那岂不是第一步特异性很差

takara的kit（ TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit ：http://www.docin.com/p-1308436.h ... 泶锬懿荒苋媚憷斫狻�

郁闷~~不过正如你说热不对称的条件也很麻烦。。。。
刚去做了个自环化，做了7份，明早来收样，乙醇浓缩下。再PCR~希望能有带。。

你之前说你PCR经常有单引物扩增现象不是inverse PCR吧？
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13楼2010-11-21 11:04:54
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
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Originally posted by adslye at 2010-11-21 11:04:54:


takara的kit（ TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit ：[url]http://www.docin.com/p-1308436.html）就是那样设计的，但是接头的5‘端没有磷酸基团，因此理论上第一轮PCR接头引物无法工作。可是我的实验发现， ...

inverse也有过，而且都比较诡异
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14楼2010-11-23 13:02:46
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
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用walking or RACE来做不行吗，为什么要做反向呢？
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15楼2010-11-23 14:38:35
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
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Originally posted by linxi8579 at 2010-11-23 14:38:35:
用walking or RACE来做不行吗，为什么要做反向呢？

这个问题比较尴尬，因为这个基因我用RACE和TAIL都没做出来，所以想试试INVERSE
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16楼2010-11-23 20:15:43
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
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Originally posted by lhwei1987 at 2010-11-23 20:15:43:

这个问题比较尴尬，因为这个基因我用RACE和TAIL都没做出来，所以想试试INVERSE

你这个基因也太困惑了吧，反向太麻烦了。walking 不行啊，用韩国的seegene的，很好做的。你是什么材料
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17楼2010-11-24 14:13:36
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
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Originally posted by linxi8579 at 2010-11-24 14:13:36:

你这个基因也太困惑了吧，反向太麻烦了。walking 不行啊，用韩国的seegene的，很好做的。你是什么材料

SEEGENE是公司还是方法？我做的是银杏，一个若有若无的基因....
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18楼2010-11-24 16:07:59
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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Originally posted by lhwei1987 at 2010-11-24 16:07:59:

SEEGENE是公司还是方法？我做的是银杏，一个若有若无的基因....

是一个公司，他的walking试剂盒很好用的。你整一个若有若无的基因？挺玄的啊
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19楼2010-11-26 08:48:04
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
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Originally posted by linxi8579 at 2010-11-26 08:48:04:

是一个公司，他的walking试剂盒很好用的。你整一个若有若无的基因？挺玄的啊

是啊，拿出来就是重大发现，拿不出来就是一个杯具....
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20楼2010-11-26 10:00:21
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