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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题已有6人参与

用cDNA环化的方法做IPCR ，使用RNA Lagise 加25%PEG18h环化，环化后立即PCR总是可以出带，但是-20过夜再进行PCR的时候就一直得不到任何条带，不知道怎么回事，哪位可以给分析一下，谢谢！！
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1楼2010-11-19 19:35:21
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adslye

银虫 (正式写手)
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lstt09nk(金币+2):鼓励交流 2010-11-26 09:37:23
引用回帖:
Originally posted by lhwei1987 at 2010-11-21 10:51:32:

我觉着TAIL体系条件也并不是很好把握；接头为什么两边加呢，那岂不是第一步特异性很差

takara的kit（ TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit ：http://www.docin.com/p-1308436.h ... 泶锬懿荒苋媚憷斫狻�

郁闷~~不过正如你说热不对称的条件也很麻烦。。。。
刚去做了个自环化，做了7份，明早来收样，乙醇浓缩下。再PCR~希望能有带。。

你之前说你PCR经常有单引物扩增现象不是inverse PCR吧？
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13楼2010-11-21 11:04:54
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hwamg

银虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-21 10:09:03
lz 你想想反向PCR的原理吧。环话的DNA你放-20℃，有可能内部局部配对，形成自身的二级机构。接着做PCR的过程中即使变性（denaturing）不一定能解开这个复杂的二级结构

解决这个问题，你可以试着适当延长变性时间

[ Last edited by hwamg on 2010-11-20 at 16:15 ]
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3楼2010-11-20 16:13:02
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adslye

银虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by lhwei1987 at 2010-11-19 19:35:21:
用cDNA环化的方法做IPCR ，使用RNA Lagise 加25%PEG18h环化，环化后立即PCR总是可以出带，但是-20过夜再进行PCR的时候就一直得不到任何条带，不知道怎么回事，哪位可以给分析一下，谢谢！！

楼主，你好。
虽然我帮不上你，但是我想请求你帮助。
我做的是双链DNA i-PCR,但是我没有自身环化的资料。分子克隆也只是写了尽量低的浓度。
可否把你自环化的详细步骤和体系公布下。谢谢！！！

另外，个人认为你-20过夜后，DNA抱团了，40°水浴1小时，让它们温和的舒张开，也许好点。另外，环状DNA做模板PCR本来就困难，多重复也许能行。
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4楼2010-11-20 23:50:30
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wangy0908

金虫 (正式写手)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
顶一下。收获了。我也是在做的inverse pcr。但是怎么也扩不出来。正在郁闷中
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5楼2010-11-21 03:51:56
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