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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题已有6人参与

用cDNA环化的方法做IPCR ，使用RNA Lagise 加25%PEG18h环化，环化后立即PCR总是可以出带，但是-20过夜再进行PCR的时候就一直得不到任何条带，不知道怎么回事，哪位可以给分析一下，谢谢！！

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1楼 2010-11-19 19:35:21

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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)

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引用回帖:

Originally posted by linxi8579 at 2010-11-23 14:38:35:
用walking or RACE来做不行吗，为什么要做反向呢？

这个问题比较尴尬，因为这个基因我用RACE和TAIL都没做出来，所以想试试INVERSE

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16楼2010-11-23 20:15:43

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hwamg

银虫 (正式写手)

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★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-21 10:09:03

lz 你想想反向PCR的原理吧。环话的DNA你放-20℃，有可能内部局部配对，形成自身的二级机构。接着做PCR的过程中即使变性（denaturing）不一定能解开这个复杂的二级结构

解决这个问题，你可以试着适当延长变性时间

[ Last edited by hwamg on 2010-11-20 at 16:15 ]

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3楼2010-11-20 16:13:02

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adslye

银虫 (正式写手)

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

引用回帖:

Originally posted by lhwei1987 at 2010-11-19 19:35:21:
用cDNA环化的方法做IPCR ，使用RNA Lagise 加25%PEG18h环化，环化后立即PCR总是可以出带，但是-20过夜再进行PCR的时候就一直得不到任何条带，不知道怎么回事，哪位可以给分析一下，谢谢！！

楼主，你好。
虽然我帮不上你，但是我想请求你帮助。
我做的是双链DNA i-PCR,但是我没有自身环化的资料。分子克隆也只是写了尽量低的浓度。
可否把你自环化的详细步骤和体系公布下。谢谢！！！

另外，个人认为你-20过夜后，DNA抱团了，40°水浴1小时，让它们温和的舒张开，也许好点。另外，环状DNA做模板PCR本来就困难，多重复也许能行。

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4楼2010-11-20 23:50:30

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