【求助/交流】染色质免疫共沉淀 - 动植物 - 综合其他 - 第2页小木虫论坛-学术科研互动平台

11楼2010-11-04 21:57:26

风云白荷

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reasonspare:如果我没有猜错的话，你的超声波和前面冲有说的不同，他们说是水浴那种 “中间不休息哈哈“，你所用的是探头那种，它是虫友给你线索是可以摸索的，固定中等率， 10s 超声，30s 间隔，你可以改变循环次数，10个循环不行15, 20, 30, 40, 哈哈。注意随时换冰。 2010-11-05 11:47:57
reasonspare:编辑内容 2010-11-05 11:57

引用回帖:

Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-04 21:57:26:
难道我上面说的时间梯度还不够明确么

谁来告诉我，我的表达到底存在神马问题……………………

时间梯度没问题，难道我的超声波破碎和你的不一样吗？你超声波破碎的时候不是要设置功率，超声波破碎的时间，还有间隔时间吗？难道你的破碎中间不休息的吗？机器一直在工作吗？那样热量不是很大吗

——————————————————————————-
发现自己写得自己也看不清楚再来一遍：

如果我没有猜错的话，你的超声波和前面“三磷酸”说的不同，他们说的是水浴那种 “中间不休息哈哈“，设定功率（功率调节比较粗糙，没有超声频率，只有个超声频率）后只能调整时间，非常温和的水浴超声仪。你所用的是探头那种（可供选择的参数：超声频率，超声频率（前边两个参数不一定都出现，不同厂家有异），超声时间，间隔时间，循环次数），这种超声波功率很大，产生大量的热，所以必须冰浴。

但是三磷酸虫友给你线索还是可以参考，固定中等率或者频率通常10-50, （超过100，要减少超声时间，否则打碎不光你的DNA 蛋白，还有你的探头）， 10s 超声，30s 间隔，你可以改变循环次数，10个循环不行15, 20, 30, 40, 哈哈。注意随时换冰

————————————————————————————

[ Last edited by reasonspare on 2010-11-5 at 11:57 ]

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12楼2010-11-05 09:21:31

曾秀凤

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我还以为那种实验就只有交给一些大公司去做呢原来自己实验室也可以做的呀唉我们浪费了

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13楼2010-11-05 11:01:57

风云白荷

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引用回帖:

Originally posted by 风云白荷 at 2010-11-05 09:21:31:

时间梯度没问题，难道我的超声波破碎和你的不一样吗？你超声波破碎的时候不是要设置功率，超声波破碎的时间，还有间隔时间吗？难道你的破碎中间不休息的吗？机器一直在工作吗？那样热量不是很大吗

— ...

谢谢您的回复，我是按照那个梯度来摸索的，但是想摸索到具体片断长度还是挺困难的，我已经试过很多条件了，不好弄。

14楼2010-11-05 14:57:45

magy2006

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好高深的学问……

15楼2010-11-05 16:33:10

z-w-p

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请问一下，您做ChIP是自己配的试剂还是有商品化的试剂盒可以直接用？

16楼2012-02-12 15:41:00

15103323277

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请问你的超声破碎条件是什么啊

17楼2016-07-10 21:16:26

萝卜涨价了

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引用回帖:

10楼: Originally posted by 风云白荷 at 2010-11-04 20:03:02
你好，谢谢你的回复，你说的那个步长，我知道是什么意思，我不明白的是你这个步长指的是超声波破碎的总时间还是指破碎的时候间隔休息的那个时间呢？
...

两个都不是这个步长是指每次要加的时间，比如第一次是1，那么第二次时间就是1+步长，第三次时间就是在第二次时间的基础上再加上步长。

18楼2018-04-28 09:13:51

萝卜涨价了

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另外给楼主的问题只涉及到了免疫共沉淀最开始的部分，顺便分享一下免疫共沉淀的实验操作步骤：
1.用预冷的磷酸缓冲液洗涤细胞两次，最后一次吸干磷酸缓冲液；
2.加入预冷的RIPA Buffer（1 ml/10^7个细胞、10 cm培养皿或150 cm^2培养瓶，0.5 ml/5×10^6个细胞、6cm培养皿、75cm培养瓶）;
3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮离，把悬液转移到干净的1.5ml EP管中。并置于低速摇床，4℃缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；
4.4℃，14000rpm离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；
5.将Protein A/G琼脂糖珠用磷酸缓冲盐溶液洗两遍，用磷酸缓冲盐溶液配制成50%的Protein A/G琼脂糖珠工作液，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；
6.在样品中以每1ml中加100μl的比例，加入50%的Protein A/G琼脂糖珠工作液。水平摇床4℃摇动10min（EP管插冰上，置水平摇床上），该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白；
7.4℃，14000rpm离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A/G琼脂糖珠；
8.做蛋白标准曲线（Bradford 法），测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）；
9.用磷酸缓冲液将总蛋白稀释到1μg/μl以降低裂解液中去垢剂的浓度。如果觉得你的目的蛋白的浓度低了，可以将总蛋白浓度提高到10μg/μl（假设浓度足够）;
10.加入一定体积的抗体到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因与它有作用的蛋白在不同细胞系中的多少而异；
11.4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h；激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育；
12.加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2μl过渡抗体；
13.14000rpm瞬时离心5s，收集沉淀，并且用预冷的洗涤缓冲液（或者预冷的磷酸缓冲盐溶液）洗涤3遍（每次加入800μl），RIPA Buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用磷酸缓冲盐溶液；
14.用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）；
15.以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性；
通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；
2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15min；
3.收集上清（约30 ml）并加入30 μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h；
4.加入0.9 ml的琼脂糖蛋白A悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min；
5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗琼脂糖蛋白A混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次；
6.吸出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min；
7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜；
8.通过考马斯亮蓝染色(测定蛋白质含量属于染料结合法的一种)观察蛋白质泳带；
9.从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min；
10.用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再进行电洗脱；
11.通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽进行Edman降解测序。
(原文地址：www.detaibio.com/topics/mygcd-1.html)

19楼2018-04-28 09:24:48