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风云白荷

铜虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】染色质免疫共沉淀已有8人参与

各位大虾，大家有没有做这个的啊？我是个新手，想向各位请教一下超声波破碎的条件摸索，从哪几个方面入手，因为它要求片断要破碎到200-1000bp，我怎么破都在200-1500左右，请不吝赐教！

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1楼2010-11-01 17:29:37

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萝卜涨价了

铜虫 (初入文坛)

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另外给楼主的问题只涉及到了免疫共沉淀最开始的部分，顺便分享一下免疫共沉淀的实验操作步骤：
1.用预冷的磷酸缓冲液洗涤细胞两次，最后一次吸干磷酸缓冲液；
2.加入预冷的RIPA Buffer（1 ml/10^7个细胞、10 cm培养皿或150 cm^2培养瓶，0.5 ml/5×10^6个细胞、6cm培养皿、75cm培养瓶）;
3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮离，把悬液转移到干净的1.5ml EP管中。并置于低速摇床，4℃缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；
4.4℃，14000rpm离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；
5.将Protein A/G琼脂糖珠用磷酸缓冲盐溶液洗两遍，用磷酸缓冲盐溶液配制成50%的Protein A/G琼脂糖珠工作液，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；
6.在样品中以每1ml中加100μl的比例，加入50%的Protein A/G琼脂糖珠工作液。水平摇床4℃摇动10min（EP管插冰上，置水平摇床上），该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白；
7.4℃，14000rpm离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A/G琼脂糖珠；
8.做蛋白标准曲线（Bradford 法），测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）；
9.用磷酸缓冲液将总蛋白稀释到1μg/μl以降低裂解液中去垢剂的浓度。如果觉得你的目的蛋白的浓度低了，可以将总蛋白浓度提高到10μg/μl（假设浓度足够）;
10.加入一定体积的抗体到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因与它有作用的蛋白在不同细胞系中的多少而异；
11.4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h；激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育；
12.加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2μl过渡抗体；
13.14000rpm瞬时离心5s，收集沉淀，并且用预冷的洗涤缓冲液（或者预冷的磷酸缓冲盐溶液）洗涤3遍（每次加入800μl），RIPA Buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用磷酸缓冲盐溶液；
14.用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）；
15.以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性；
通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；
2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15min；
3.收集上清（约30 ml）并加入30 μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h；
4.加入0.9 ml的琼脂糖蛋白A悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min；
5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗琼脂糖蛋白A混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次；
6.吸出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min；
7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜；
8.通过考马斯亮蓝染色(测定蛋白质含量属于染料结合法的一种)观察蛋白质泳带；
9.从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min；
10.用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再进行电洗脱；
11.通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽进行Edman降解测序。
(原文地址：www.detaibio.com/topics/mygcd-1.html)