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[交流] 【转帖】培养细胞的污染及排除已有5人参与

细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。
凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染
细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性

细胞污染的分类
物理污染
化学污染
生物污染（支原体污染）
控制污染
掌握良好的无菌操作技术
建立细胞库
合理应用抗生素
保持工作区清洁
建立良好的规章制度
检测细胞污染

一、污染途径
空气：每立方米含菌数不应超过1－5个
器材：
操作：
血清：
组织样本：

二、对细胞的影响
生长缓慢，分裂相减少，细胞变粗糙，轮廓增强，胞浆多颗粒状物。重者细胞增殖停止，分裂相消失，胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。

细胞污染的种类和判定
细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染：
培养液的酸碱度发生异常的改变。
培养液出现混浊。
光镜观察到菌丝和颗粒。
细胞出现死亡或增殖缓慢等。

三、污染物的检测
1. 真菌污染
常见真菌种类：多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等
真菌污染判断：
肉眼可见培养液中见白色或黄色漂浮物，
倒置镜下见细胞间纵横交错，丝状、管状、树枝悬浮飘荡的菌丝或形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长，
培养液多不混浊。
2.细菌污染
常见细菌种类：大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单孢菌等
细菌污染判断：
培养液颜色变黄，出现混浊
镜下观察，大量圆球状颗立漂浮，细胞表面和周围有大量细菌
细胞生长停止，并有中毒表现

细菌和真菌污染的检测：
涂片染色镜检；
接种培养：Trypticase大豆肉汤、BHI、Thioglycocollate肉汤和血琼脂板适于广泛的细菌检测；Sabouraud肉汤、YM肉汤和营养肉汤适于检测真菌。
检测到阳性结果后，应高压灭菌处理污染的培养物及其用具

3.支原体:
常见而棘手。
支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。
支原体检测方法和处理：
荧光技术检测：支原体含有DNA，能与荧光染料Hoechest33258特异性的结合，可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体。
相差显微镜：相差油镜下呈暗色微小颗粒。
电镜观察：SEM，TEM。
DNA分子杂交：检出率高但复杂。
检测完毕后，所有实验用具均应经过高压消毒处理。

污染支原体后的处理：
抗生素处理：如加入泰乐菌素等。
共培养法：与巨噬细胞共培养。
重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4-5周后，重复克隆2次。
过滤法：0.22µm孔径滤膜正压过滤。

4.污染病毒的检测
致细胞病变效应（CPE）或集落的检测：采用相差显微镜检测
血细胞吸附试验；
四、细胞间交叉污染
为避免细胞间交叉污染，应注意：
了解各细胞系的特征；
培养各细胞系的操作手续要快速；
培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等；
吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和酶的瓶内；
经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染。

五、微生物污染的防治
抗生素:联合应用,常用量的5－10倍,用药24－48小时,对早期污染有效.
加温处理:针对支原体污染, 41度5－10小时,最长不超过18小时.
动物体内接种:将受到污染的细胞接种在同种动物皮下或腹腔,借动物体内的免疫系统消灭微生物.
资料来源：www.yiqi120.com/zlzx.asp

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