| 查看: 3304 | 回复: 7 | ||||||
| 当前主题已经存档。 | ||||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||||
[交流]
本人收集的激光共聚焦常见荧光染料染色方法
|
||||||
|
Hoechst 33258染色 固定液 50 ml Hoechst 33258染色液 50 ml 抗荧光淬灭封片液 5 ml 说明书 1 份 保存条件： 4℃保存，Hoechst 33258染色液需4℃避光保存。本试剂盒自订购之日起六个月内有效。 注意事项： Ø 需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。 Ø 需PBS或0.9%NaCl溶液。 Ø 需盖玻片与载玻片。 Ø 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。 Ø 在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。 使用说明： 1. 贴壁细胞 A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。 B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。 C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。 D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。 E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。 G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，详细图谱请参考下图。 2. 悬浮细胞 A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。 B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。 C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。 D. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。 E. 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。 F. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 G. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左. 3. 组织切片 A. 对于任何常见切片，处理至常规可以进行免疫染色时，或完成常规的免疫染色后，即可进行后续的Hoechst染色。 B. PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。可在六孔板中操作。 C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动。 D. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 E. 将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 F. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右， Hoechst 33258的吸收光谱和发射光谱，左侧峰为吸收光谱，右侧峰为发射光谱。 DAPI染核 原理： 主要结合dsDNA；结合小沟的AT。DAPI也结合RNA，但其发射峰波长（500nm）要长于DAPI/dsDNA（460nm）。 DAPI dilactate更水溶。在用于组织染色、未固定细胞和组织染色时，下述方法可加以修改。 保存： 10mg/单位，室温避光保存，小瓶内至少一年。制stock液，溶解100uM （DAPI dihydrochloride二盐酸化物分子量为350.3；DAPI dilactate分子量为457.5）DAPI于去离子水中或DMF(二甲基甲酰胺)，4℃避光可保存6个月。 DAPI是诱变剂，水溶液可通过活性炭去除，要安全处理。 染色： 在所有染色完成后进行复染，不需要另外的固定和通透处理。 荧光显微镜复染方法： 1. PBS平衡 2. PBS稀释DAPI stock液至300nM，滴加300μL这种稀释液于细胞上。 3. 孵育5分钟。 4. PBS中涮洗几次，涳干过量缓冲液，抗淬灭剂封片。 FISH复染： 样品在dH2O中洗以去除残留缓冲盐溶液，有助于减少玻片上非特异背景。 1. PBS中稀释至30nM，吸300μL滴于样品上，塑料玻片有助于平均分配染料。 2. 黑暗室温孵育30分钟。 3. 去掉盖玻片，PBS和dH2O中小心盥洗。 4. 去掉过量液体，绵纸在样品边缘小心吸取。 5. 盖上盖玻片，蜡或指甲油封片。或按供应商的指导加抗淬灭剂。 荧光显微镜观察。 Rhodamine 123 染色 中文名称：罗丹明 123 目 的：测细胞内线粒体的跨膜电位 EX/EM： 505/534 染液配制： 罗丹明123 粉剂用甲醇配制成1mg/ml的储备液，100ul/支分装，-20℃保存。染色时用Dulbecco’s PBS缓冲液将其稀释为5ug/ml。 染色步骤： 培养细胞 Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗2～3次(缓冲液预热至室温或37℃) Rhodamine 123(5ug/ml) 37℃孵育1小时 Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗2～3次 加0.5ml Dulbecco’s PBS，上机测量 Fluo-3-AM 染色 (测细胞内游离钙离子浓度) 染液配制：Fluo-3-AM 50ug溶于45ul DMSO(Fluo-3-AM浓度 1mM)，15ul/支分装，-20℃保存。染色时用15～50mM HEPES缓冲液将其稀释为1～20uM(如1.5ml 为10uM)。 染色步骤： 培养细胞 缓冲液漂洗2～3次 Fluo-3-AM (1～20uM) 37℃或室温孵育0.5～1小时 缓冲液漂洗2～3次 加0.5ml 缓冲液，上机测量。 先发到这，有什么问题欢迎指正，本人操作激光共聚焦，积累些经验，愿与大家共享。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 Optical | 掌握科研前沿 | 墨痕心迹 |
» 猜你喜欢
三峡大学材料与化工学院环境功能材料课题组招生硕士调剂生
已经有0人回复
-
燕山大学先进结构材料团队招收金属材料相关方向
已经有0人回复
-
金属材料论文润色/翻译怎么收费?
已经有62人回复
-
08类有较多调剂名额，欢迎各位考生联系咨询。
已经有0人回复
-
重庆长江师范学院材料工程接收材料类和机械类考生调剂硕士研究生
已经有26人回复
-
重庆长江师范学院材料工程接收材料类考生调剂硕士研究生
已经有0人回复
-
天津大学化学工程专业专业课
已经有0人回复
-
二氧化铂的XRD和XPS 检测结果完全对不上，这是为什么？？？？
已经有0人回复
-
332，085601求调剂
已经有14人回复
-
英语一来了就有
已经有0人回复
-
福建理工大学招收英语一 数学一或者二
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
genghong2006
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 9355.3
- 红花: 2
- 帖子: 919
- 在线: 179.2小时
- 虫号: 196845
- 注册: 2006-02-24
- 性别: GG
- 专业: 大气环境与全球气候变化
6楼2007-03-02 00:47:22
tangmnt
至尊木虫 (职业作家)
- 应助: 12 (小学生)
- 贵宾: 0.001
- 金币: 29234.8
- 散金: 971
- 红花: 6
- 帖子: 3937
- 在线: 154.7小时
- 虫号: 186623
- 注册: 2006-02-16
- 性别: MM
- 专业: 计算机应用技术
4楼2006-07-23 09:19:35
7楼2007-03-04 08:26:51
8楼2007-03-22 09:57:15
