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gaoshandian1

金虫 (小有名气)

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[交流] 传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）和第二代差异显示系统

　

真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的分化、凋亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。高等生物大约有30 000个不同的基因，但在生物体内任意细胞中只有10%的基因得以表达，而这些基因的表达是按事件和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。其包括新出现的基因表达与表达量有差异的基因表达。生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差异表达引起的。由于基因差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。
研究基因差异表达的主要技术有差别杂交（筛选）（differential hybridization）、扣除（消减）杂交（subtractive hybridization of cDNA， SHD）、mRNA差异显示（mRNA differential display， DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization， SSH）、代表性差异分析（represential display analysis， RDA）、交互扣除ＲＮＡ差别显示技术（reciprocal subtraction differential RNA display）以及基因表达系列（serial analysis of gene expression， SAGE）分析和电子消减（electronic subtraction）和DNA微列阵分析（DNA microarray）等。

这里我们重点介绍传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）和第二代差异显示系统：限制性酶切片段差异显示（RFDD-PCR）
传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5'-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。

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