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hnndpt

铁虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】文献中的一点问题，理解不了！！！

Library screening, cloning and sequencing
Two degenerate primers (TL3, 5￠-TTYGAICAYCCITAYCCICCIACIAARYIIAGTTT-
3￠ and TL4, 5￠-CATIGGGTCRATICCRTTIGGICCIGCIACIGTNGG-
3￠) were designed from AtTTG1 to amplify 700 bp from putative cotton homologues.Amplified fragments were ligated to pGEM-T Easy (Promega) and used to transform E. coli DH5-a F0 cells (Promega). The insert from one clone was released by EcoRI digestion, oligolabelled (Hodgson and Fisk, 1987) and used to
probe a 12 DPA (days post-anthesis) cotton fibre cDNA library.

result中与之呼应的结果：
Initially, two degenerate TTG1 PCR primers were used to amplify a 700 bp fragment from cotton genomi cDNA. Nucleotide sequencing of four clones
revealed two distinct, but very similar, sequences.

问题：最后怎么会出现 Nucleotide sequencing of four clones？这个four是怎么来的？用1对简并引物去扩增700bp的片段，假如说扩增出了4个不同的片段，这4个片段又怎么分开？重点是那个4 clones是怎么回事？看了两篇文献都有这个。
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1楼 2010-10-06 18:58:53
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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文献杰出贡献
hnndpt(金币+5):非常感谢！ 2010-10-07 17:03:56
呵呵，不是提到连接到 pGEM-T Easy载体上了么，然后又随即测序了。或者经过RFLP使之分型，最后有两个明显差异的pattern，送去测序，得到two distinct, but very similar, sequences。再仔细看看文章，应该有randomly select 或者RFLP分型之类的词语的。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2010-10-07 08:43:54
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-10-07 08:43:54:
呵呵，不是提到连接到 pGEM-T Easy载体上了么，然后又随即测序了。或者经过RFLP使之分型，最后有两个明显差异的pattern，送去测序，得到two distinct, but very similar, sequences。再仔细看看文章，应该有rand ...

非常感谢！还有一点需要请教：
文中没有提到RFLP，如果用简并引物扩增出来的序列连接到载体以后，怎么对其测序？随机选择几个克隆进行测序吗？这样的话会不会把扩增出的不同序列遗漏了？（譬如说扩增出了5个不同的片段，而你却选择了4个克隆送去测序，这样是否就遗漏了一个？）
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3楼2010-10-07 17:03:42
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
引用回帖:
Originally posted by hnndpt at 2010-10-07 17:03:42:

非常感谢！还有一点需要请教：
文中没有提到RFLP，如果用简并引物扩增出来的序列连接到载体以后，怎么对其测序？随机选择几个克隆进行测序吗？这样的话会不会把扩增出的不同序列遗漏了？（譬如说扩增出了5个不 ...

是随机挑克隆测序的，呵呵。T载体上不是有引物么，就用T载体通用引物测序。
会出现类似情况的，呵呵，所以一般至少都送10多个样品去测序的。不过按照你这篇文章的意思是随机挑了4个测序，然后得到两个不同的序列。

我曾经做过一个类似的工作，28个克隆经过RFLP后分为了13个pattern，所以要是送少了的话，估计就不会出来这么多了。一般情况下都是做一个RFLP的，然后送不同的Pattern测序。
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4楼2010-10-07 19:01:14
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