24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 926  |  回复: 4
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请教一个克隆的问题,很棘手!已有4人参与

最近在做一个克隆,一端是pmeI酶切,一端是EcoRI酶切,片段是300bp,载体大小是4.3kb左右,我将片段TA克隆后再用两个酶分别单酶切,单酶切时间尝试过4-5h,9-10h两种,中间用乙醇沉淀浓缩后换另一个酶切相同的时间后割胶回收连接,也尝试了用这两个酶一切做双酶切过夜后割胶回收连接,长出来的转化子提取质粒进行酶切验证,要么就是条带不对,要么就是空载,已经重复做了很多次,很是郁闷,请教这里的高手指点一下,盼回复了,谢谢!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

glidingwater

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
平板的转化子全部检测了?多挑几个检测吧!
如果单酶切成功的话,那很有可能可以得到阳性克隆。
如果社会的黑暗侵蚀了学府,我该往何处?
3楼2010-09-07 08:34:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答

寂寞之巅

铁虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
空载 可能是你酶切不完全
好好学习,天天向上
2楼2010-09-07 08:27:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ottolzm

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你的片段里有没有你所选择的酶切位点?还有就是 进行分步酶切的时候这个顺序和酶切体系的选择等很重要 所以 先不要看时间 先看看上述问题 再往下分析
4楼2010-09-07 08:35:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲

★ ★
silicare(金币+2):谢谢参与 2010-09-07 11:59:53
1、pmeI???确定?
2、两个缓冲体系不一样的酶切,注意先用哪一个!先用好切的!回收量回大一些!切开之后的自链问题???
3、是否有甲基化的影响?分析一下序列。
4、酶切时候注意酶的用量!甘油会影响活性,长时间酶切会 star活性!
5、用快速RE吧,很快!
5楼2010-09-07 09:48:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复(可上传附件)
信息提示
请填处理意见