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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】是非特异性吸附吗？
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吓猴蹲

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】是非特异性吸附吗？ 已有1人参与

原理：以多聚酪氨酸多肽为底物，在ATP存在条件下，用提取的酪氨酸激酶催化底物酪氨酸的磷酸化，用酶标记的单克隆抗体检测酪氨酸磷酸化程度，以OPD做为辣根过氧化物酶底物显色。
过程：
1.包被 多肽20mg/l包被96孔板，每孔100ul,4度过夜
2.封闭 150ul 5%BSA/PBS,37度2小时
3.洗板 20mmol/l PBST-20(0.05%),洗板5次，每次5分钟
4.加入50ul 200ng/ml 的酪氨酸激酶溶液，25ul 5umol/l的ATP/MnCl2反应5分钟
5.加入25ul 500mM EDTA终止反应
6.PBST洗板5次
7.加100ul 用1%BSA/PBS 1:1000稀释的抗体，室温反应15分钟
8.显色 OPD溶液避光显色，7分钟
9.加入100ul 2.5N H2SO4终止反应
10.读数
-ATP-Kinase-Ab+OPD           OD值0.043 0.044 0.048
-ATP-Kinase+Ab+OPD                 0.051 0.051 0.057
+ATP-Kinase+Ab+OPD                0.063 0.060 0.061
-ATP+Kinase+Ab+OPD                0.110 0.108 0.103
-ATP+Kinase-Ab+OPD                 0.040 0.042 0.044
+ATP+Kinase+Ab+OPD               0.105 0.102 0.103
-ATP+Kinase+Ab+OPD+激酶抑制剂       0.070 0.068 0.075
+ATP+Kinase+Ab+OPD+激酶抑制剂        0.078 0.071
从结果来看，第4组与第6组OD值相当，是否加ATP对结果无影响；第8组加激酶抑制剂，抑制激酶活性，阻碍底物发生磷酸化，OD值减小，但第7组，未加入ATP，加入激酶抑制剂结果与第8组OD值相当。
1. 这会不会说明我的实验原理是行不通的呢？
2. Kinase在整个的过程中并未发挥使底物发生磷酸化的作用呢？
没辙了，请各位帮我分析分析啊！感激啊！
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一分一分，省到结婚
1楼 2010-08-26 18:36:38
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看天

木虫 (知名作家)
顶  不太熟悉
回复此楼
戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
2楼2010-11-20 17:50:13
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