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吓猴蹲木虫 (正式写手)
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原理：以多聚酪氨酸多肽为底物，在ATP存在条件下，用提取的酪氨酸激酶催化底物酪氨酸的磷酸化，用酶标记的单克隆抗体检测酪氨酸磷酸化程度，以OPD做为辣根过氧化物酶底物显色。 过程： 1.包被 多肽20mg/l包被96孔板，每孔100ul,4度过夜 2.封闭 150ul 5%BSA/PBS,37度2小时 3.洗板 20mmol/l PBST-20(0.05%),洗板5次，每次5分钟 4.加入50ul 200ng/ml 的酪氨酸激酶溶液，25ul 5umol/l的ATP/MnCl2反应5分钟 5.加入25ul 500mM EDTA终止反应 6.PBST洗板5次 7.加100ul 用1%BSA/PBS 1:1000稀释的抗体，室温反应15分钟 8.显色 OPD溶液避光显色，7分钟 9.加入100ul 2.5N H2SO4终止反应 10.读数 -ATP-Kinase-Ab+OPD OD值0.043 0.044 0.048 -ATP-Kinase+Ab+OPD 0.051 0.051 0.057 +ATP-Kinase+Ab+OPD 0.063 0.060 0.061 -ATP+Kinase+Ab+OPD 0.110 0.108 0.103 -ATP+Kinase-Ab+OPD 0.040 0.042 0.044 +ATP+Kinase+Ab+OPD 0.105 0.102 0.103 -ATP+Kinase+Ab+OPD+激酶抑制剂 0.070 0.068 0.075 +ATP+Kinase+Ab+OPD+激酶抑制剂 0.078 0.071 从结果来看，第4组与第6组OD值相当，是否加ATP对结果无影响；第8组加激酶抑制剂，抑制激酶活性，阻碍底物发生磷酸化，OD值减小，但第7组，未加入ATP，加入激酶抑制剂结果与第8组OD值相当。 1. 这会不会说明我的实验原理是行不通的呢？ 2. Kinase在整个的过程中并未发挥使底物发生磷酸化的作用呢？ 没辙了，请各位帮我分析分析啊！感激啊！ |
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2楼2010-11-20 17:50:13
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