| 查看: 192 | 回复: 1 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
3257197木虫 (正式写手)
森林木虫
|
[交流]
原位杂交操作规程
|
||
|
二、 原位杂交操作规程 （一）、仪器设备 医用微波炉； 水浴锅。 （二）、试剂 0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容0.5L。 0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml，H20 定容0.4L。 .5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，浓HCl 4ml，H20 定容0.98L，醋酸酐 （用 前加）2.5ml。 20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸橼酸钠 88.2g，H20 定容1L。 100×Denhardt's：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容50ml。 杂交液：Formamide 5ml，20×SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100×Denhardt's 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。 BufferⅠ（pH7.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.15mol/L NaCl。 BufferⅢ（pH9.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。 BufferⅣ（pH8.0）：10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA。 （三）、操作流程 1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交 第一天 1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2） 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟； 4） PBS清洗3分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗10分钟； 7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟； 8） PBS清洗2次，每次3分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次3分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟； 12）PBS清洗2次，每次5分钟； 13）预杂交缓冲液孵育30分钟； 14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟； 15）杂交； 第二天 16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片； 17）PBS清洗3分钟； 18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟； 19）PBS清洗5分钟； 20）室温，2×SSC清洗10分钟； 21）37℃，1×SSC清洗10分钟； 22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟； 23）缓冲液A孵育10分钟； 24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟； 25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时； 26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟； 27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟； 28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时； 29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗； 30）固红，脱水以及封片进行核的复染。 2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交 第一天 1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2） 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟； 4） PBS清洗5分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗5分钟； 7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟； 8） PBS清洗2次，每次5分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次5分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟； 12）PBS清洗5分钟； 13）预杂交缓冲液孵育30分钟； 14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针； 15）杂交； 第二天 16）将玻片置于SSC中以去除封片； 17）室温，2×SSC清洗10分钟； 18）37℃，1×SSC清洗10分钟； 19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟； 20）缓冲液A孵育10分钟； 21）缓冲液A孵育30分钟； 22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时； 23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟； 24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟； 25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时； 26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗； 27）固红，脱水以及封片进行核的复染。 |
回复此楼» 猜你喜欢
直面医事危机住院医师的人生“大考”
已经有0人回复
-
中医学学习指导习题集（第2版）
已经有0人回复
-
医学免疫学论文润色/翻译怎么收费?
已经有156人回复
-
内分泌常见疾病专家答疑
已经有0人回复
-
一志愿苏大105500初试343求调剂
已经有3人回复
-
重症医学科诊疗要点-杨殿武-2019
已经有0人回复
-
重症医学科诊疗实践
已经有1人回复
-
重症医学监护与应用-白静-2021
已经有0人回复
-
胆道外科微创化治疗系统解决方案要点解析
已经有0人回复
-
有没有大神？今年什么时间放榜？
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
2楼2006-04-23 16:00:13
100