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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【分享】-三磷酸腺苷-答疑专帖，我也来玩~~
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
scelab(金币+3):这个~ 2010-10-07 23:10:00
引用回帖:
Originally posted by hnndpt at 2010-10-06 17:28:11:
我现在要确认一下某个结构基因在植物体内有几个拷贝，有两个问题不明白：
1.利用这个结构基因的保守序列做探针去检测结构基因的拷贝数*（sourthern），每个基因不是还有等位基因吗？会不会在检测的过程中把一对等 ...

1、人是二倍体，大多数情况下，基因都是成对成对的。因此在做southern的时候总是把这一对等位基因呈现在同一条带位置上，你可以先简单认为这对染色体携带的基因都是几乎一样的（虽然事实上不是如此，但southern的检出能力有限，所以……）。而位于不同染色体位置的同一个基因很可能出现在另外的条带位置上。这样解释明白吧

2、非也，等位基因的话，有可能其中一个是会被关闭的。
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101楼2010-10-06 17:56:34
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-10-06 17:56:34:


1、人是二倍体，大多数情况下，基因都是成对成对的。因此在做southern的时候总是把这一对等位基因呈现在同一条带位置上，你可以先简单认为这对染色体携带的基因都是几乎一样的（虽然事实上不是如此，但southe ...

非常明白，十分感谢，这个问题困扰我几天了。
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102楼2010-10-06 18:40:43
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-10-07 23:10:10
To amplify 159-bp of the DBD, two degenerate `universal' MYB primers,COT20 (5¢-GGNAARAGYTGYMGITTRAG-3¢ and COT21 (3¢-GGNCCKKCTTGTCTRTTRS-5¢ were designed based on the highly conserved stretches coding for the peptides GKSCRL and PGRTDN, respectively (Fig. 1a). Using 25 ll of recombinant
phage (3.4 ´ 107 pfu/l) from the same unampli®ed library as the template, 。。。。。。反应条件省略。。。. The 159-bp amplicon was cloned into the pT7Blue TA-cloning vector and transformed into competent E.
coli NovaBlue cells (Novagen). Nucleotide sequencing (Sanger et al. 1977) of 24 independent transformants identi®ed a total of six different MYB DBDs. Equal amounts of the 159-bp amplicon from each of the six PCR clones, released by EcoRI digestion, were combined in a heterogeneous pool of DBD sequences for use as a homologous hybridization probe.
我想问个问题：24 independent transformants 是怎么来的？
2.设计简并引物扩增出来的序列，怎么判断出是几个不同的片段？我看的几篇文章中都是直接连接入载体，然后挑选N个克隆测序，这一点有点不太明白，是否随机挑选克隆？这样会不会导致克隆出来的不同片段会被遗漏？
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103楼2010-10-07 17:14:58
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
1、随便挑的吧……意思就是从24个转化子中坚定出6个不同的DBD（人家就爱24……）
2、测了个序~当然是随机挑的，多挑点就好啦~~


========
居然不能自删……
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104楼2010-10-07 18:02:38
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by hnndpt at 2010-10-07 17:14:58:
To amplify 159-bp of the DBD, two degenerate `universal' MYB primers,COT20 (5¢-GGNAARAGYTGYMGITTRAG-3¢ and COT21 (3¢-GGNCCKKCTTGTCTRTTRS-5¢ were designed based ...

1、随便挑的吧……意思就是从24个转化子中坚定出6个不同的DBD（人家就爱24……）
2、测了个序~当然是随机挑的，多挑点就好啦~~


我忘记引用了……
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105楼2010-10-07 18:03:06
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
关于southern探针的问题再请教：
现在克隆出一个基因编码区的全长了，请问怎么做探针？
是不是用随机引物标记法将此序列标记为探针？
今天看的随机引物标记法不太明白：1，如果用这个基因序列去制作探针，探针的序列应该不是基因的全长吧，能否保证探针的序列在400--600（书上推荐探针的长度）核苷酸？

今天看的文献说克隆出了一个700bp的片段，然后用它做探针去筛选文库，问题：他说的探针是不是就是这个700bp的序列？（只不过加过标记而已）
结果筛选出了两个克隆，命名为AtTTG1和AtTTG2，然后有用AtTTG1做探针去筛选文库，又筛选出1个克隆，最终证明此基因有3个拷贝与GtTTG同源。
问题：是不是因为AtTTG1序列比700bp片段做的探针长，所以能额外筛选出一个？新手上路，请多指教,Thanks!
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106楼2010-10-07 20:38:11
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
scelab(金币+1):呵呵，以后做一下，给他们具体的答案 2010-10-07 23:11:04
引用回帖:
Originally posted by hnndpt at 2010-10-07 20:38:11:
关于southern探针的问题再请教：
现在克隆出一个基因编码区的全长了，请问怎么做探针？
是不是用随机引物标记法将此序列标记为探针？
今天看的随机引物标记法不太明白：1，如果用这个基因序列去制作探针，探针 ...

关于southern的进一步技术细节我就不懂了，毕竟没亲自做过，都是从原理上给你一些简单的解释。最好能够问问真正做过这个实验的研究生。
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107楼2010-10-07 21:17:48
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)

自由人，我型我秀！

优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
还是想请教一下，细胞抗癌的检测手段之类的，麻烦了。
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人生不过几十年，成败荣辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快乐最值钱，自古人间苦无边，看得高远境如仙，愿你不为凡事恼，轻松快乐每一天。
108楼2010-10-12 10:57:14
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=1999662
ATP,上面的资料你下过么
能否给我传一份
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小木虫之有关部门负责人
109楼2010-10-12 11:03:24
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by dhd997 at 2010-10-12 10:57:14:
还是想请教一下，细胞抗癌的检测手段之类的，麻烦了。

这个问题太泛了，有没有稍微具体一点的…………
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110楼2010-10-12 12:22:45
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