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nancy1984木虫 (小有名气)
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[交流]
HPLC的砂芯漏斗，流动相，柱子保存问题
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刚开始进行HPLC实验，同实验室的人都不熟，只有在这求助各位亲爱的虫友了 1.不知道最标准的保存砂芯漏斗的方法是怎么样的。我砂芯漏斗主要过滤的是色谱纯的甲醇，乙晴，和水。我用完砂芯漏斗后，先用三次蒸馏水冲洗几次，然后用干净的纸巾包好，放进塑料袋内，在放抽屉保存。实验室没有什么防尘柜之类的。。。不知道这样可不可以？因为试剂买来的都是MERK公司色谱纯，我觉得应该都是很纯的试剂。 2.我每次都是过虑大约1L的流动相，甲醇，乙晴，和水，放在进口的试剂瓶中。但连续用了两次，也就是两天都用不完。因为试剂很贵，我想以后每次都少过滤一点，500mL应该也够一次用了的。但是一个师兄说，他们实验室每次都用1L的容量。我也不知道他这样子的依据是什么。我现在用完两次，还都留有300mL左右，近几天又不会再用。我想是不是必须倒掉，下次用之前再过滤新的，少过滤些，500ML的量就行。还是就可以放在室温下保存，然后隔几天用之前再超声呢?这样子，感觉瓶子又不干净了。。。大家一般是配多少呢？ 3.我是分析有机物质，用C18的反相色谱柱。实验样品测完后，我先用水冲洗30min,在用乙晴冲洗1h，然后柱子就放在HPLC的仪器上，不取下来。因为近期那个仪器都是我用。虽然有时候是隔几天。不知道这样子对柱子影响大不大？还是必须取下来，两端密封保存。 4. 另外，看有的人说，直接买的色谱纯试剂，作流动相时可以不用砂芯漏斗过滤，真是这样子吗？  |
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nancy1984
木虫 (小有名气)
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4楼2010-08-06 19:21:25
ganchunlei
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nancy1984(金币+1):谢谢~~ 2010-08-06 20:21:59
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1. 缓冲液的流动相，用前一定要过滤，可以用5号沙芯漏斗。漏斗用毕要清洗，如果长期不用建议在烘箱中110度烘一烘，起到灭菌作用。 用了含缓冲液的流动相，做完HPLC后，滤头和管道建议用纯水冲洗。 2. HPLC 流动相的缓冲液缓冲液流动相可以根据下面的操作步骤配制: 1. 将缓冲液药品溶解在水中制成缓冲液(溶液 A) . 2. 用 pH 计确定或调节溶液 A 的 pH. 3. 将一定体积(如 200ml)的有机溶剂 B 与由步骤 2 配制的溶液 A(如 800ml)混合,制成最 终流动相(此处的有机相为 20%) . 4. 检查最终流动相的 pH(此处为选项) . 由于测定含有有机调节剂的流动相 pH 计发生漂移,使其测定 pH 不很可靠,所以上面的步骤 4 一般只有在考察误差的主要来源时采用,大多数实验室皆略去此步骤. 步骤 1 一般是将配制缓冲液所用的两种试剂(A1 和 A2)分别按计算量先溶解在水中制成水溶 液,然后再将这两种溶液按一定的比例混合得到预期 pH 的溶液 A.若在此步骤 2 中调节 pH,则可以 采用溶剂 A 滴定溶剂 B,也可反过来滴定,并通过 pH 计测量得到所需 pH 的最终缓冲溶液.在大多 数实验室中,pH 的测量精度通常不会达到±0.05—0.1 个 pH 单位,这会显著影响一些样品的分离. 当 HPLC 方法对 pH 非常敏感时,步骤 2 只能大致确定 pH 值. 将准确称重的缓冲液配制试剂与精确体积的脱气蒸馏水混合,使其成为均一的溶液(不进一步 调整 pH) ,如此配得得缓冲溶液得 pH 可以控制在非常窄得范围内(±0.02 单位) ,已知准确 pH 值得 缓冲液浓溶液已有市售. 为了改善峰形或塔板数,有时在流动相中加入酸或碱(如三乙胺,乙酸等) ,如果这些添加剂并 非为配制缓冲溶液时所采用得试剂,那么将这些试剂加入到流动相中后,还需重新滴加酸或碱,使 流动相达到所需的 pH 值. 常用缓冲液的配制 当缓冲液被稀释或浓缩时,pH 也应不变.其 pH 值应近似恒定不变,或当其中的离解的阳离子 + + (K ,Na )或阴离子(Cl ,Br )被其它种类的离子替换时,表 1—4 中给出了响应的配制方法,平 + + 衡阳离子为 Na ,缓冲液的最终浓度为 0.1mol/l,对于其它浓度的缓冲溶液或阳离子种类(通常 K ) 更好,表中的数据也可供参考.较稀的或较浓的缓冲溶液,及包含有不同阳离子的溶液,其 pH 值会 与表中的数据稍有出入.在方法建立过程中,精确的流动相 pH 值往往并不重要,重要的是每次新配 制的流动相的 pH 值与第一次基本相同(最好控制在±0.02 范围内) .注意,只有当缓冲溶液的 pH I 在缓冲试剂解离常数 pK a±1 范围内时,缓冲溶液才具有有效的缓冲容量(如乙酸盐的 pKa=4.6,其 适宜的 pH 范围为 3.6—5.6) . 表 1 低 pH 值(25℃)磷酸盐缓冲溶液的配制方法 溶液 A1:0.1M 磷酸.配制精确 pH 值缓冲液时,所用磷酸需滴定 H3PO4 的含量. 溶液 A2:0.1M 磷酸二氢钠溶液,称量 13.8g NaH2PO4H2O 溶解于水中,定容于 1L 容量瓶中. pH A1 体积(ml) A2 体积(ml) pH A1 体积(ml) A2 体积(ml) 2.0 565 435 2.8 175 825 2.2 455 545 3.0 110 890 2.4 345 655 3.2 55 945 2.6 250 750 表 2 不同 pH 值(25℃)醋酸缓冲溶液的配制方法 溶液 A1:0.1M 醋酸溶液.6.0g(5.8ml)冰醋酸溶于水中,定容到 1L 容量瓶中. 溶液 A2:0.1M 醋酸钠溶液.8.2g C2H3O2Na(或 13.6g C2H3O2Na3H2O)溶解于水中定容到 1L 容量瓶中. pH A1 体积(ml) A2 体积(ml) pH A1 体积(ml) A2 体积(ml) 3.6 926 74 4.8 400 600 3.8 880 120 5.0 296 704 4.0 820 180 5.2 210 790 4.2 736 264 5.4 176 824 4.4 610 390 5.6 96 904 4.6 510 490 表 3 不同 pH 值(25℃)柠檬酸缓冲溶液的配制方法 溶液 A1:0.1M 柠檬酸溶液.21.0g 柠檬酸溶于水中,定容到 1L 容量瓶中. 溶液 A2:0.1M 柠檬酸钠溶液.29.4g C6H5O7Na32H2O 溶解于水中,定容到 1L 容量瓶中. pH A1 体积(ml) A2 体积(ml) pH A1 体积(ml) A2 体积(ml) 3.0 930 70 5.2 360 660 3.2 870 126 5.4 320 680 3.4 810 190 5.6 270 726 3.6 750 260 5.8 230 764 3.8 700 300 6.0 190 810 4.0 660 340 6.2 140 856 4.2 610 370 6.4 60 940 4.4 560 440 6.6 40 960 4.6 510 490 6.8 30 970 4.8 460 540 7.0 10 985 5.0 410 590 表 4 中等 pH 值(25℃)磷酸缓冲液的配制方法 溶液 A1:0.1M 磷酸二氢钠溶液.13.8g NaH2PO4H2O 溶于水中,定容到 1L 容量瓶中.溶液 A2:0.1M 磷酸氢二钠溶液.26.8g Na2HPO47H2O(或 35.9g Na2HPO412H2O)溶于水中,定容到 1L 容量瓶中. pH A1 体积(ml) A2 体积(ml) pH A1 体积(ml) A2 体积(ml) 5.6 948 52 7.0 390 610 5.8 920 80 7.2 280 720 6.0 877 123 7.4 190 810 6.2 815 185 7.6 130 870 6.4 735 265 7.8 85 915 6.6 685 315 8.0 53 947 6.8 510 490 表 5 和 6 给出了适于 pH=7—10.6 范围的两种有机碱缓冲液配制方法, 这种有机碱缓冲液可以有效低 减缓硅胶基柱的柱效降低. 表 5 高 pH(25℃)甘氨酸缓冲溶液的配制方法 溶液 A1:0.2M 甘氨酸.15.01g 甘氨酸溶于水中,定容于 1L 容量瓶中. 溶液 A2:0.1M NaOH 溶液,稀释较浓的 NaOH 溶液. pH A1 体积(ml) A2 体积(ml) pH A1 体积(ml) 8.6 25 2.0 9.6 25 8.8 25 3.0 9.8 25 9.0 25 4.4 10.0 25 9.2 25 6.0 10.4 25 9.4 25 8.4 10.6 25 表 6 高 pH 值(25℃)Tris 缓冲溶液的配制方法 溶液 A1:0.1M Tris(无碱) ,12.11g Tris 溶于水中,定容到 1L 容量瓶中. 溶液 A2:0.1M HCl 溶液,稀释较浓 HCl 溶液. pH A1 体积(ml) A2 体积(ml) pH A1 体积(ml) 7.1 50 45.7 8.1 50 7.2 50 44.7 8.2 50 7.3 50 43.4 8.3 50 7.4 50 42.0 8.4 50 7.5 50 40.3 8.5 50 7.6 50 38.5 8.6 50 7.7 50 36.5 8.7 50 7.8 50 34.5 8.8 50 7.9 50 32.0 8.9 50 8.0 50 29.2 A2 体积(ml) 11.2 13.6 16.0 19.3 22.75 A2 体积(ml) 26.2 22.9 19.9 17.2 14.7 12.4 10.3 8.5 7.0 3. 缓冲液的配置（最佳方法） 1．将缓冲液药品溶解在水中制成缓冲液(溶液A) 2. 用pH计确定或调节溶液A的pH。 3．将一定体积(如200mL)的有机溶剂B与由步骤2配制的溶液A(如800mL)混合，制成最终流动相(此处的有机相为20％) 4．检查最终流动相的pH(此步骤为选项) 由于测定含有有机调解剂的流动相pH计发生飘移，使其测定pH不很可靠．所以上面的步骤4一般只有在考察误差的主要来源时采用，大多数实验室皆略去此步骤。 另 外要注意上表中调节剂的浓度，不适当的浓度和波长选择，会造成基线本底吸收太高，基线不稳，影响分析。要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作洗脱的 流动相。有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵（pH5.16）做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时 就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。 |
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