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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【分享】关于载体双酶切的一些经验
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swordhang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-07-30 12:00:06:
PCR产物酶切，你考虑效率了吗？

3-6kb  pcr产物效率应该不会太低，我做过pet29a和puc19，酶切效率你用什么方法都会有，但pcr的载体即使酶切不完全也不会自连
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11楼2010-07-30 14:06:20
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swordhang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 刘小乐 at 2010-07-30 10:30:31:
方法不错的，不过有个疑问想请教一下，载体是环状质粒吗？引物怎么设计的？

和设计普通引物没有区别
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12楼2010-07-30 14:07:44
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nnsulei

金虫 (正式写手)
★
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怕P出来的片段 有突变啊 ~
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努力做就有结果～
13楼2010-08-02 15:52:03
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
★ ★
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lstt09nk(金币+1):鼓励交流~~ 2010-08-02 17:15:05
PCR载体序列，保证PCR过程中没有突变，感觉可行性很小~~载体双酶切还是比较好弄的，可以分步酶切，因为是双酶切，自连应该很小，但要保证两个酶的酶切效果都比较好，在做链接的时候需要做个对照，就是降酶切产物直接进行连接反应，如果不是建库什么的，挑出重组子还是比较可以的
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14楼2010-08-02 16:38:28
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用两种酶分别单酶切然后交叉酶切就知道载体能不能被切开了
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
15楼2010-08-03 18:15:56
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tanxi125

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你为啥这样切呢，是不是为了摸索条件，PCR扩增可能会出现扩增错误，如果恰好出现在酶切问点，可能就切不了了 啊，到时候就不知道是啥原因了~
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什么都得靠自己！我现在深刻理解！
16楼2011-01-12 14:53:31
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sanmaoecho

金虫 (小有名气)
★
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酶切载体体系做大一点，载体量少一点，时间长一点，一般就切完全了，真不成就回收之后用碱性磷酸酶处理一下载体，就不会自连接了
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我们对於那份面向未来的勇气，过於渴求而被过去所迷惑
17楼2011-01-12 21:30:19
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xiezhenrong

金虫 (正式写手)

北斗星
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
想法新颖，倒可借鉴一下
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海阔凭鱼跃，天高任鸟飞！
18楼2011-03-23 12:04:45
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
既然自己都连不上，那加上外源ＤＮＡ还能连上吗？
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一直向前！
19楼2011-03-23 13:33:23
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shan-sa

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
么有看懂LZ的方法是怎么个情况里
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20楼2011-03-23 15:59:12
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