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shaojing690新虫 (初入文坛)
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【分享】分子生物学实验常用试剂、缓冲液的配制方法 已有49人参与
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分子生物学实验常用试剂、缓冲液的配制方法 1、1M Tris-HCl □组份浓度 1 M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0） □配制量 1L □配制方法 1. 称量121.1gTris置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。 pH值 浓HCl 7.4 约70mL 7.6 约60mL 8.0 约42mL 4. 将溶解定容至1L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 2、1.5 M Tris-HCl □组份浓度 1.5 M Tris-HCl （pH8.8） □配制量 1L □配制方法 1.称取181.7gTris置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 用浓盐酸调pH值至8.8。 4. 将溶液定容至1L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 3、10×TE Buffer □组份浓度 100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA （pH 7.4，7.6，8.0） □配制量 1L □配制方法 1. 量取下列溶液，置于1L烧杯中。 1 M Tris-HCl Buffer（pH7.4，7.6，8.0） 100mL 500 mM EDTA（pH8.0） 20mL 2. 向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。 3. 将溶液定至1L后，高温高压灭菌。 4. 室温保存。 4、3 M醋酸钠 □组份浓度 3 M 醋酸钠 （pH5.2） □配制量 100mL □配制方法 1. 称取40.8gNaOAc•3H2O置于100～200mL烧杯中，加入约40mL的去离子水搅拌溶解。 2. 加入冰乙酸调节pH值至5.2。 3. 加入去离子水将溶液定容至100mL。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。 5、PBS Buffer □组份浓度 137 mM NaCl，2.7mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4 □配制量 1L □配制方法 1. 称量下列试剂，置于1L烧杯中。 NaCl 8 g KCl 0.2g Na2HPO4 1.42 g KH2PO4 0.27g 2. 向烧杯中加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加HCl将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1L。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。 6、10 M醋酸铵 □组份浓度 10 M醋酸铵 □配制量 100mL □配制方法 1. 称量77.1g醋酸铵置于100～200 mL烧杯中，加入约30 mL的去离子水搅拌溶解。 2.加去离子水将溶液定容至100mL。 3.使用0.22μm滤膜过滤除菌。 4.密封瓶口于室温保存。 注意：醋酸铵受热易分解，所以不能高温高压灭菌。 7、Tris- HCl平衡苯酚 □配制方法 1. 使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物，这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。因此，苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要，我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。 2. 操作注意：苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等。所有操作均应在通风橱中进行，与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。 3. 苯酚平衡：因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相，因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上，苯酚平衡操作方法如下： ① 液化苯酚应贮存于-20℃，此时的苯酚呈现结晶状态。从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温，然后在68℃水浴中使苯酚充分溶解。 ② 加入羟基喹啉（8-Quinolinol）至终浓度0.1％。该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂，同时因其呈黄色。有助于方便识别有机相。 ③ 加入等体积的1M Tris-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌器搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相。 ④ 重复操作步骤③。 ⑤ 加入等体积的0.1M Tris-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌器搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相。 ⑥ 重复操作步骤⑤，稍微残留部分上层水相。 ⑦ 使用pH试纸确认有机相的pH值大于7.8。 ⑧ 将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存。 8、苯酚/氯仿/异戊醇 □配制方法 1. 说明：从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯/酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白（25 ：24 ：1） 质变性并有助于液相与有机相的分离，而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。 2. 配制方法：将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇（24：1）均匀混合后，移入棕色玻璃瓶中4℃保存。 9、10％（W/V）SDS □组份浓度 10％（W/V）SDS □配制量 100mL □配制方法 1.称量10g高纯度的SDS置于100～200mL烧杯中，加入约80mL的去离子水，68℃加热溶解。 2. 滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。 3. 将溶液定容至100mL后，室温保存。 10、2 N NaOH □组份浓度 2N NaOH □配制量 100mL □配制方法 1.量取80mL去离子水置于100～200mL塑料烧杯中（NaOH溶解过程中大量放热，有可能使玻璃烧杯炸裂）。 2. 称取8g NaOH小心地逐渐加入到烧杯中，边加边搅拌。 3. 待NaOH完全溶解后，用去离子水将溶液体积定容至100mL。 4. 将溶液转移至塑料容器中后，室温保存。 11、2.5 N HCl □组份浓度 2.5 N HCl □配制量 100mL □配制方法 1. 在78.4mL的去离子水中加入21.6mL的浓盐酸（11.6N），均匀混合。 2. 室温保存。 12、5 M NaCl □组份浓度 5 M NaCl □配制量 1L □配制方法 1. 称取292.2g NaCl置于1L烧杯中，加入约800mL的去离子水后搅拌溶解。 2. 加去离子水将溶液定容至1L后，适量分成小份。 3. 高温高压灭菌后，4℃保存。 13、20％（W/V）Glucose □组份浓度 20％（W/V）Glucose □配制量 100mL □配制方法 1. 称取20g Glucose置于100～200mL烧杯中，加入约80mL的去离子水后，搅拌溶解。 2. 加去离子水将溶液定容至100mL。 3. 高温高压灭菌后，4℃保存。 14、Solution I □组份浓度 25 mM Tris-HCl（pH8.0），10mM EDTA，50mM Glucose （质粒提取用） □配制量 1L □配制方法 1. 量取下列溶液，置于1L烧杯中。 1M Tris-HCl（pH8.0） 25mL 0.5 M EDTA（pH8.0） 20mL 20％Glucose（1.11M） 45mL dH2O 910mL 2. 高温高压灭菌后，4℃保存。 3. 使用前每50 mL的Soliution I中加入2mL的RNase A（20mg/mL）。 15、Solution II □组份浓度 250mM NaOH，1％（W/V）SDS （质粒提取用） □配制量 500mL □配制方法 1. 量取下列溶液置于500mL烧杯中。 10％SDS 50mL 2N NaOH 50mL 2. 加灭菌水定容至500mL，充分混匀。 3. 室温保存。此溶液保存时间最好不要超过一个月。 注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 16、Solution III □组份浓度 3M KOAc，5M CH3COOH （质粒提取用） □配制量 500mL □配制方法 1. 量取下列溶液置于500mL烧杯中。 KOAc 147g CH3COOH 57.5mL 2. 加入300mL去离子水后搅拌溶解。 3. 加去离子水将溶液定容至500mL。 4. 高温高压灭菌后，4℃保存。 17、0.5M EDTA □组份浓度 0.5 M EDTA (pH8.0) □配制量 1L □配制方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌。 3. 用NaOH调节pH值值8.0（约20g NaOH）。 注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。 4. 加去离子水将溶液定容至1L。 5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。 6. 室温保存。 18、1 M DTT □组份浓度 1 M DTT □配制量 20mL □配制方法 1. 称取3.09g DTT，加入到50mL塑料离心管内。 2. 加20mL的0.01 M 的NaOAc（pH5.2），溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。 3. 适量分成小份后，-20℃保存。 19、10mM ATP □组份浓度 10mM ATP □配制量 20mL □配制方法 1. 称取121mg Na2ATP•3H2O，加入到50mL塑料离心管内。 2. 加20mL的25mM Tris-HCl（pH8.0），搅拌溶解。 3. 适量分成小份，-20℃保存 [ Last edited by silicare on 2014-2-18 at 17:21 ] |
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