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shaojing690

新虫 (初入文坛)

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专业: 生物大分子结构与功能

[交流] 【分享】分子生物学实验常用试剂、缓冲液的配制方法已有49人参与

分子生物学实验常用试剂、缓冲液的配制方法
1、1M Tris-HCl       □组份浓度 1 M Tris-HCl
（pH7.4，7.6，8.0） □配制量 1L
                           □配制方法 1. 称量121.1gTris置于1L烧杯中。
                                                   2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。
                                                   3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。
                                                      pH值                   浓HCl
                                                      7.4                      约70mL
                                                      7.6                      约60mL
                                                      8.0                      约42mL
                                                   4. 将溶解定容至1L。
                                                   5. 高温高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

2、1.5 M Tris-HCl    □组份浓度 1.5 M Tris-HCl
（pH8.8）             □配制量 1L
                              □配制方法 1.称取181.7gTris置于1L烧杯中。
                                                2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。
                                                3. 用浓盐酸调pH值至8.8。
                                                4. 将溶液定容至1L。
                                                5. 高温高压灭菌后，室温保存。
   注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

3、10×TE Buffer       □组份浓度 100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA
（pH 7.4，7.6，8.0）  □配制量 1L
                              □配制方法 1. 量取下列溶液，置于1L烧杯中。
                                                   1 M Tris-HCl Buffer（pH7.4，7.6，8.0） 100mL
                                                   500 mM EDTA（pH8.0） 20mL
                                                2. 向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。
                                                3. 将溶液定至1L后，高温高压灭菌。
                                 4. 室温保存。
4、3 M醋酸钠       □组份浓度 3 M 醋酸钠
（pH5.2）          □配制量 100mL
                              □配制方法 1. 称取40.8gNaOAc•3H2O置于100～200mL烧杯中，加入约40mL的去离子水搅拌溶解。
                                                2. 加入冰乙酸调节pH值至5.2。
                                                3. 加入去离子水将溶液定容至100mL。
                                                4. 高温高压灭菌后，室温保存。

5、PBS Buffer       □组份浓度 137 mM NaCl，2.7mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4
                              □配制量 1L
                              □配制方法 1. 称量下列试剂，置于1L烧杯中。
                                                   NaCl                   8 g
                                                   KCl                   0.2g
                                                   Na2HPO4       1.42 g
                                                   KH2PO4          0.27g
                                                2. 向烧杯中加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解。
                                                3. 滴加HCl将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1L。
                                                4. 高温高压灭菌后，室温保存。
   注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。

6、10 M醋酸铵       □组份浓度 10 M醋酸铵
                              □配制量 100mL
                              □配制方法 1. 称量77.1g醋酸铵置于100～200 mL烧杯中，加入约30 mL的去离子水搅拌溶解。
                                                2.加去离子水将溶液定容至100mL。
                                                3.使用0.22μm滤膜过滤除菌。
                                                4.密封瓶口于室温保存。
   注意：醋酸铵受热易分解，所以不能高温高压灭菌。

7、Tris- HCl平衡苯酚 □配制方法
   1. 使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物，这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。因此，苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要，我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。
   2. 操作注意：苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等。所有操作均应在通风橱中进行，与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。
   3. 苯酚平衡：因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相，因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上，苯酚平衡操作方法如下：
      ① 液化苯酚应贮存于-20℃，此时的苯酚呈现结晶状态。从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温，然后在68℃水浴中使苯酚充分溶解。
      ② 加入羟基喹啉（8-Quinolinol）至终浓度0.1％。该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂，同时因其呈黄色。有助于方便识别有机相。
      ③ 加入等体积的1M Tris-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌器搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相。
      ④ 重复操作步骤③。
      ⑤ 加入等体积的0.1M Tris-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌器搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相。
      ⑥ 重复操作步骤⑤，稍微残留部分上层水相。
      ⑦ 使用pH试纸确认有机相的pH值大于7.8。
      ⑧ 将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存。

8、苯酚/氯仿/异戊醇 □配制方法
      1. 说明：从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯/酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白（25 ：24 ：1）质变性并有助于液相与有机相的分离，而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。
      2. 配制方法：将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇（24：1）均匀混合后，移入棕色玻璃瓶中4℃保存。

9、10％（W/V）SDS □组份浓度 10％（W/V）SDS
                                 □配制量 100mL
                                 □配制方法 1.称量10g高纯度的SDS置于100～200mL烧杯中，加入约80mL的去离子水，68℃加热溶解。
                                                   2. 滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。
                                                   3. 将溶液定容至100mL后，室温保存。

10、2 N NaOH          □组份浓度 2N NaOH
                              □配制量 100mL
                              □配制方法 1.量取80mL去离子水置于100～200mL塑料烧杯中（NaOH溶解过程中大量放热，有可能使玻璃烧杯炸裂）。
                                                2. 称取8g NaOH小心地逐渐加入到烧杯中，边加边搅拌。
                                                3. 待NaOH完全溶解后，用去离子水将溶液体积定容至100mL。
                                                4. 将溶液转移至塑料容器中后，室温保存。

11、2.5 N HCl          □组份浓度 2.5 N HCl
                              □配制量 100mL
                              □配制方法 1. 在78.4mL的去离子水中加入21.6mL的浓盐酸（11.6N），均匀混合。
                                                2. 室温保存。

12、5 M NaCl          □组份浓度 5 M NaCl
                              □配制量 1L
                              □配制方法 1. 称取292.2g NaCl置于1L烧杯中，加入约800mL的去离子水后搅拌溶解。
                                                2. 加去离子水将溶液定容至1L后，适量分成小份。
                                                3. 高温高压灭菌后，4℃保存。

13、20％（W/V）Glucose □组份浓度 20％（W/V）Glucose
                                          □配制量 100mL
                                          □配制方法 1. 称取20g Glucose置于100～200mL烧杯中，加入约80mL的去离子水后，搅拌溶解。
                                                            2. 加去离子水将溶液定容至100mL。
                                                            3. 高温高压灭菌后，4℃保存。

14、Solution I          □组份浓度 25 mM Tris-HCl（pH8.0），10mM EDTA，50mM Glucose
（质粒提取用）          □配制量 1L
                                 □配制方法 1. 量取下列溶液，置于1L烧杯中。
                                                      1M Tris-HCl（pH8.0）          25mL
                                                         0.5 M EDTA（pH8.0）          20mL
                                                         20％Glucose（1.11M）          45mL
                                                         dH2O                                  910mL
                                                   2. 高温高压灭菌后，4℃保存。
                                                   3. 使用前每50 mL的Soliution I中加入2mL的RNase A（20mg/mL）。

15、Solution II          □组份浓度 250mM NaOH，1％（W/V）SDS
（质粒提取用）          □配制量 500mL
                                 □配制方法 1. 量取下列溶液置于500mL烧杯中。
                                                      10％SDS                      50mL
                                                      2N NaOH                      50mL
                                                   2. 加灭菌水定容至500mL，充分混匀。
                                                   3. 室温保存。此溶液保存时间最好不要超过一个月。
                                                      注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

16、Solution III       □组份浓度 3M KOAc，5M CH3COOH
（质粒提取用）          □配制量 500mL
                              □配制方法 1. 量取下列溶液置于500mL烧杯中。
                                                      KOAc                         147g
                                                      CH3COOH                   57.5mL
                                                   2. 加入300mL去离子水后搅拌溶解。
                                                   3. 加去离子水将溶液定容至500mL。
                                                   4. 高温高压灭菌后，4℃保存。

17、0.5M EDTA          □组份浓度 0.5 M EDTA
   (pH8.0)                □配制量 1L
                                 □配制方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。
                                                   2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌。
                                                   3. 用NaOH调节pH值值8.0（约20g NaOH）。
                                                      注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。
                                                   4. 加去离子水将溶液定容至1L。
                                                   5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
                                                   6. 室温保存。

18、1 M DTT             □组份浓度 1 M DTT
                              □配制量 20mL
                              □配制方法 1. 称取3.09g DTT，加入到50mL塑料离心管内。
                                                2. 加20mL的0.01 M 的NaOAc（pH5.2），溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。
                                                3. 适量分成小份后，-20℃保存。

19、10mM ATP          □组份浓度 10mM ATP
                                 □配制量 20mL
                                 □配制方法 1. 称取121mg Na2ATP•3H2O，加入到50mL塑料离心管内。
                                                   2. 加20mL的25mM Tris-HCl（pH8.0），搅拌溶解。
                                                   3. 适量分成小份，-20℃保存

[ Last edited by silicare on 2014-2-18 at 17:21 ]

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