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louli

铜虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

连接的时候，载体与目的片段加入的比例不对

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11楼2010-07-23 20:02:44

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睡着数绵羊

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专业: 细胞信号转导

引用回帖:

Originally posted by louli at 2010-07-23 20:02:44:
连接的时候，载体与目的片段加入的比例不对

有什么公式吗？

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12楼2010-07-26 14:11:41

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canon-ph

铜虫 (小有名气)

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专业: 植物病理

感受态很重要还有转化后要摇菌好多都不摇的

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13楼2010-07-27 11:09:43

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shuiyue2728

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专业: 发育生物学

连接之前不是酶切么，酶切条带怎么样，还有就是感受态的原因呢，用的什么抗生素涂板之前还是要37度复苏一下

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14楼2010-07-27 15:58:38

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zhizaibide

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★
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学习了。。。

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15楼2010-07-28 09:44:06

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bunny0512

银虫 (小有名气)

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专业: 细胞生物学研究中的新方法

★ ★
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lstt09nk(金币+1):最近很活跃~~ 2010-08-02 16:59:59

额你用的化转还是电转啊?我老是告诉我,用化转比较稳妥,我转化出过一板二三百的菌落;但是通常也就几十个;所以建议用电转,电转理论上会更多.电转的小细节一定要注意...要不效果可是很差的...

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在哪里~在哪里见过你~

16楼2010-07-28 09:48:25

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刘小乐

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★
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菌少不要紧的，把每个转化子做菌落PCR，跑DNA电泳看看有没有目的基因条带，有的话就可以了，然后再扩大培养

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互动互利互相学习

17楼2010-07-28 09:58:19

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hulinyong

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★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-08-02 17:00:25

我看楼主是不是用的PCR产物回收后直接进行酶切后连接的呀？
我觉得你的目的不在于长出来多少克隆，而在于这些克隆里有没有你要的片段。你的目的应该不是建什么文库吧，所以只要有目的克隆长出来就OK了。
个人觉得菌落PCR的方法假阳性或是假阴性比较多，可以试着用快速裂解法看一下有没有连接上片段或者挑上几个克隆提质粒做一下酶切，看有没有目的片段插入。

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18楼2010-07-28 10:31:52

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睡着数绵羊

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引用回帖:

Originally posted by hulinyong at 2010-07-28 10:31:52:
我看楼主是不是用的PCR产物回收后直接进行酶切后连接的呀？
我觉得你的目的不在于长出来多少克隆，而在于这些克隆里有没有你要的片段。你的目的应该不是建什么文库吧，所以只要有目的克隆长出来就OK了。
个人觉 ...

谢谢啦！

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19楼2010-07-28 11:01:00

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空谷幽风

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★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

重组的效率比酶切连接要低的多，再加上热击法的转化效率本身就不高，所以重组质粒转化后长的斑少是正常的

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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?

20楼2010-08-02 14:58:48

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