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PCR技术操作程序和优化方法
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PCR技术操作程序和优化方法 典型的PCR操作 在此处仅列出—般PCR操作过程，具体影响因素的优化将在本章第二节讨论，每一个具体操作前都需进行必要的优化。 (一) 试剂 (1)引物根据待扩增DNA不同，引物亦不同，引物的设计见本章第三节。 (2)耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温(93—100c)， 不同耐热DNA聚合酶的特性详见本章第4节。 Perkin—E1mer—cetus公司、 N、F、Bio1ab、PharMacia公司、国内华美公司、复旦．大学和中国医学科学院友谊公司等均有商品供应。 (3)10x PCR缓冲液： 500mm01／L KCl； 100mmol／L Tris一HCl(pH8.4， 20c)， 150mmol／L MgCl2， lmg／m1明胶o ““ (4)5mmo1／L dNTP贮备液：将dATP，dCTP，dGTPT和dTTP钠盐各100mg合 并，加3m1灭菌去离子水溶解，用NaoH调pH至中性，分装每份300v1， (-) 20℃保存c dNTP浓度最好用uv吸收法精确测定。另外。现在已有中性dNTP溶液商品供应 (Sigma公司和Pharmacia公司等). (5)标本处理试剂：不同标本所需试剂不同，根据具体情况而定〔见本章第6节)G (二) 操作程序 利用PcR扩增的操作程序基本相同，只是根据引物与靶序列的不同，选择不同的反 应体系与循环参数(见本章第：：节)o基本的操作是将PcR必需反应成分加入一微量离心 管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。每个实验室或每个人都有不同的操 作习惯，但需遵守一定的操作规范。我们推荐下述操作程序，因这样操作可最大程度地增 加反应的成功率。 (1)向一微量离心管中依次加入： ddH20 补至终体积(终体积50~100ul) 10 x PCR缓冲液 1／10体积 dNTP 各200umol／L 引物 各1umol／L DNA模板 10*10一10*10*10*10*10拷贝 混匀后，离心15s使反应成分集于管底。 (2)加石蜡油50—100ul于反应液表面以防蒸发。置反应管于97c变性7min(染色体 DNA)或5min(质粒DNA). (3)冷至延伸温度时，加入1—5U Taq DNA聚合酶，在此温度作用1min. (4)于变性温度下使模板DNA变性适当时间。 (5)在复性温度下使引物与模板杂交一定时间。 (6)在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间。 (7)重复(4)一(6)步25—30次。每次即为一个PcR循环o (8)微量琼脂德凝胶电泳检查扩增产物(见本章第7节)o 上述过程可以用PcR自动热循环仪进行，也可以设定3个恒温水浴锅手工操作. |
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第二节 PCR条件的优化 PCR必需具备下述基本条件：①模板核酸(DNA或RNA)；②人工会成的寡核苷酸引 物；②合适的缓冲体系；①Mg2+；⑤三磷酸脱氧核苷酸；⑥耐热DNA聚合酶；⑦温度循环参 数(变性、复性和延伸的温度与时间以及循环数)o另外，还有一些其它因素，如二甲基亚 砜、甘油、石蜡油、明胶或小牛血清白蛋白等也影响某些特定PCR。下面分别讨论这些 因素在PCR反应中的作用及其对PCR的影响。 一、模扳核酸 PcR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增需首先 逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。核酸标本来源广6t可以从纯培养的细胞或 微生物中提取，也可以从临床标本(血、尿、粪便、体腔积液、嗽口水等)、犯罪现场标本 (血班、毛发、精斑等)和病理解剖标本(新鲜的或经甲醛固定石蜡包埋组织)以及考古标本 中直接提取。无论标本来源如何，待扩增核酸都需部分纯化使核酸标本中不合DNA聚 合酶抑制剂。关于核酸的具体处理方法详见本章第六节。 PcR反应中模板加入量一般为10*10一l0*10*10*10*10拷贝的靶序列。1ug人基因组DNA相当于3xl0*10*10*10*10个单拷贝的靶分子；10ng酵母DNA相当1：3xl0*10*10*10*10靶分子，1ng大肠杆菌DNA相当于3xl0*10*10*10*10靶分子；1％的M13噬菌斑相当于10*l0*10*10*10*10靶分子。因此，扩增不同拷贝数的靶序列时，加入的合靶序列的DNA量亦不同。如真核rRNA基因有200—500拷贝，反应中仅需加入0.5—2ng人基因组DNA即可。 以质粒DNA或染色体DNA为模板时的扩增最适条件是不同的。前者所需的酶量少，循环数夕，温度不如染色体DNA要求严格。扩增染色体DNA时至少需25—30循环，如在第15循环后补加一些Taq酶会获得更好的扩增效果。 扩增靶序列的长度根据不同目的而不同。用于检测目的的扩增片段长度一般为500bp以内，以100一300bp为最好。用Taq DNA聚合酶在合适条件(较长延伸时间)下，可扩 增长达10一20kb的片段。 二、引物 PCR扩增产物的大小是山特异引物限定的。因此，引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。 (一) 引物合成的质量 合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析(HPLC)纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱膘吟产物以及可检测到 的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR所用引物质量要高． 且需纯化。冻干引物干—20℃至少保存32—24个月，液体状于-20℃可保存6个月。引物不用时应存—20℃保存。 [二) 引物的设计原则 遵循一些简单的规则有助于没计PcR引物，通过微机的帮助更有利于PCR的成功。关于引物的详细设计原则与方法详见本章第三节。 (三) 引物的用量及其计算 一般PCR反应中引物的终浓度为0．2—1umol／L，在此范围内，PCR产物量基本相同。但引物低于0.2umol／L时，则产物量降低。引物浓度过高会促进引物的错误引导非 特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。 引物浓度的计算可按下面的方法进行：摩尔淬灭系数（Em)是lcm光程比色杯中测定 1mol／L寡核苷酸溶液在UV 260nm下的光密度〔0D)值。Em可按下式计算： EM＝a(16000)十b〔12000)十c(7000)十d(9600) 其中，a、b、c和d分别代表寡核苷酸中A、G、C和T的个数。 例如， —纯化的20mer寡核苷酸溶于0.1ml水中，取10ul稀释至10mL，测其 0D＝0.76。原液的0D为0.76x100=76。若此寡核苷酸碱基组成为A＝5，G＝5， C＝5*T＝5，其EM为： EM＝5(16000)十5(12000)十5(7000)十5(9600)＝223000 因此，原液个寡核苷酸的摩尔浓度为： 76／223000＝3.4x10-4moI／L=340nmol／L 三、缓冲液 目前最为常用的缓冲体系为10—50mmol／L Tris—HCl(pH8.3—8.8、20c)o Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，pKa值为-0.021／℃。因此，20mmol/L Tris一HCl(pH8.3, 20℃)在实际PCR中，PH变化于6.8—7．8之间。改变反应液的缓冲能力,如将Tris浓度加大到50mmol／L，pH 8.9，有时会增加产量。反应混合液中50mmol／L以内的KCl有利于引物的退火，50mm01／L NaCl或50mmol／L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH4+代K+,其浓度为16.6mmol／L。反应中加入小牛血清白蛋白(100ug／ml或明胶(0.01％)或Tween20(0.05％一0.1％)有助于酶的稳定， 反应中加入5mmol／L的二巯苏醇DTT)也有类似作用，尤其在扩增长片段(此时延仲时间长)比加入这些酶保护剂对PCR反应足有利的。 四、Mg2+， Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的。因此，反应中优化Mg2+浓度是非常有益 的。Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外，也影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链 温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高 时，则酶催化非特异的扩增。需指出的是，PcR混合物中的DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基因均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。Taq DNA聚合酶需要的是游离 Mg2+。因此，PCR中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.2—2.5mmol／L。最好对每种 模板，每种引物均进行Mg2+浓度的优化。另外还需注意引物和模板DNA原液中如含 EDTA等螯合剂也会影响游离Mg2+浓度。 优化Mg2+浓度法：首先须知模板DNA量，引物和dNTP浓度和设定的PcR循环参 数。反应中的PcR缓冲液中不加Mg2+。Mg2+是从10mmol／LMg2+贮存液中逐一加 入反应管中。开始以0．5mmol／L递增(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5—5.0mmol／L)，在确定 了Mg2+大概浓度以后，再在该浓度上下，以0.2mmol／L递增和递减几个浓度来精确确 定Mg2+的最适浓度。 五、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP) 贮备dNTP液应用NaoH调pH至中性，其浓度用分光光度计测定。贮备液为5— 10mmol／L，分装后—20℃保存。在PcR的重复热循环过程中共热稳定性应为：50循环后 约有50％仍为dNTP。反应小练种dNTP(dATP，dGTP，dTTP和dCTP)的终浓度为20 -200umol／L，在此范围内，PCR产物量、特异性与合成忠实性间的平衡最佳。所用的 四种dNTP终浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。开始发明PcK时，以K1enow片 段催化DNA的合成，其dNTP浓度要求1.5mmol／L，而耐热DNA聚合酶的应用使 dNTP的使用浓度明显降低，这可减少在非靶位点的错误引导和降低dNTP的错误掺 入，从而改善了PCR的特异性与忠实性。最低的适宜dNTP浓度可根据特定靶序列长度 和碱基组成来确定。如在100ul反应液中，每种dNTP若为20umol／L，理论上足以合 成2．6ugDNA或10pmol的400bp序列。有报道应用每种州20umol／L可成功地捡出 10*10*10*10*10*10*10拷贝DNA分子中一个ras点突变。但如此低浓度的dNTP在常规PCR中应避免。因为保持四种dNTP的浓度均在按种dNTPKm值(10-15umol／L)以上，对保持碱基掺入忠实性是很重要的。dNTP终浓度大于50mmol／L时会抑制TaqDNA聚合酶活性。另外，dNTP的类似物也可掺入PCR产物(参考本章第十节）。 六、耐热DNA聚合酶 自从耐热Taq DNA聚合酶引入PCR后， 又有多种耐热DNA聚合酶(VENT和Tth 等)相继用于PcR。关于各种耐热DNA聚合酶的性质详见本章第四节，但目前仍以Taq DNA聚合酶应用较多。不同来源聚合酶制备条件、测定方法和(或)单位定义有所不同， 使用时需加以注意。下面讨论的酶使用情况是以PE—cetus公司生产的Taq聚合酶为依 据的。 在其它参数最佳时，每100ul反应液中含1—2.5U(比活性为20U／pmol)TaqDNA 聚合酶为佳。然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。当优化PcR时， 最好在每100ul反应体积中加入0.5-5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果酶浓度太高， 则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩增带；过低时，则靶序列产量很低。 PCR后可通过下述方式之一灭活Taq DNA聚合酶：(1)99—100C加热10min(2)加入 EDTA Na2至10mmol／L整合Mg2+；(3)酚一氯仿抽提、乙醇沉淀PCR产物。 七、温度循环参数 (一) 变性温度与时间 PCR的变性一步很重要。此步若不能使靶基因模板和(或)PcR产物完全变性，就 会导致PCR失败。典型的变性条件是95℃30s，或97℃15s，更高的温度可能更有效， 尤其是对富合G十C的靶基因。DNA在其链分离温度(strand separation temperature， Tss)时的变性只需几秒钟，然而，反应管内部达到Tss还需一定时间。变性温度太高会影 响酶活性。最简单的方法是在加Taq聚合酶前先使模板在97℃变性7—10min,在以后的 循环中，将模板DNA在94℃或95℃变性1min，对PCR的成功亦有益处。环状质粒 DNA模板最好酶切线性化，因环状DNA复性极快。在扩增短片段(100一300bp)时，可 用简便、快速的两步PcR法，同时在5—10个循环后，将变性温度降至87—90℃可改善 PCR产量。具体降低程度则根据共体反应和使用的PCR仪而定。 (二) 复性温度与时间 如果说变性温度对PCR反应的成败是关键，那么复性温度则决定着PcR的特异 性。引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的复性温度应 低于扩增引物在PcR条件下真实Tm值的5℃。根据下式计算最适复性温度(Taopt)有助于 PCR的成功。 Taopt =0.3Tm1十0.7Tm2-14.9 其中，Tm1为引物的Tm值，Tm2为产物的Tm值。 实际上，由于模板量呈指数增加，PCR每一个循环中的Taopt均不同。因此，采用变化 的Taopt (第一循环为Taopt -8℃，以后每隔一循环增加1℃)，对扩增质粒模板中小于1kb 的靶片断是有益的(产量增加，循环数减少)，尤其对300bp以内片段的扩增更为有效。这 种变化Taopt法似乎对长片断和染色体DNA的扩增影响不大。但前几个循环在低Ta值 下进行，然后再于Taopt下扩增，可增加从染色体DNA中扩增靶序列的量。 对未知序列的扩增很难预知其G十c含量，因此，无法计算上式中的Tm2，不免暴露 了上述估算法的缺陷。另一种更简便的方法是通过引物的有效长度(1n)来信算。在此，还 需引入另一概念，即有效启动温度(effective priming temperature，Tp)。 Tp是最佳引物介 导扩增发生时的最高温度。Tp在一定范围(20一35个核苷酸)内与Ln呈直线相关。 Lp＝22十1.46(1M) (6) 其中Ln＝2(G十C)十(A十T) (7) 最适复性温度为Tp +or-2—5℃。 该法估算的最适复性温度较上法高些。Tp值较引物模板的Tss倪高5-10℃，这是 因为引物复性后，DNA聚合酶很快发生聚合反应，在引物3‘端加上数个碱基使引物—模 板更稳定，易于在较高温度下发生廷伸。 研究表明，引物的复性是受动力学因素控制的，而不是受热力学参数控制的。它取决 于引物解离与延伸效率间的平衡。Tp不仅是PcR的最适复性温度，也是PcR最佳特异 性温度，在等位基因特异PCR(As—PCR)时，决定Tp很重要。 Tp值基本上不受Mg2+浓度影响，当Mg2+由15mmol／L升至10mmol／L时，Tp才升高3℃。 确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复 性。复性时间也不能太短(＞30s)。如用手控温度反应，从复性状态移至延伸状态的时间 不能太长，耽搁过长会增加非特异复性。 (三) 延伸温度与时间 引物延伸温度一般为72℃(较复性温度高10℃左右)。不合适的延伸温度不仅会影响 扩增产物的特异性，也会影响其产量。72℃时，核苷酸的掺人率为35—100个核苷酸 ／s，这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达 2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间决定于靶序列的长度与浓度。3—4kb的靶序 列需3—4min延伸，延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现。PCR中前几个循环延伸 时间应足够长以使靶序列延伸完全，对很低浓度底物的扩增，延伸时间要长些。 (四) 循环数 循坏数决定着扩增程度。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列的初 始浓度。过多的循环会增加非特异扩增产物的数量和复杂性(见平台效应)。当然，循环数 太少，PCR产物就会极低。在初始靶序列为3x105，1.5x104，1x103和50拷贝分子 时．其循环数可分别为25—30，30一35，35—40和40一45个循环。 除循环数外，扩增效率也是决定扩增程度的重要因素。实验表明，以染色体DNA为 模板时，第25—30个循环过程中，扩增DNA量明显增加。扩增程度(Y)、起始DNA量 (A)、扩增效率(R)和循环数(n)间的关系为： Y＝A(1十R)n (8) 效率为100％时，25个循环后，Y＝225．A＝33554432A，而效率R＝90％，n＝25时， Y＝1.925＝9307649A，扩增产物减少72％，由此可见扩增效率对扩增程度的影 八、其它因素 〔一) 高温起动〔hot start) 由于Taq DNA聚合酶在低温下仍具有活性。因此在一般PcR反应的开始加热变性 DNA后再加酶的过程中，引物可与模板发生非特异复性，这些非特异复性在达到72℃前就由Taq聚合酶在其3’端聚合上几个碱基并稳定了这种非特异复性引物。因此，可出现非特异延伸和扩增。采用高温起动法便可克服这一缺点，即使Taq聚合酶仅在反应达到较高温度（大于70℃)时才发挥作用。这可通过在高温(70℃)下加入某些必需因子(DNA聚合酶，模板DNA，Mg2+或引物等)来控制。这种方法不仅可增加PcR的特异性，还能增加其敏感性，并可减少引物二聚体的形成和引物的自我复性。这是因为在扩增前加热可促进引物的特异复性与延伸，因此增加了有效引物的长度。 (二) PCR促进刑 1．二甲基亚风(DMSO)：许多耐热DNA聚合酶厂家推荐在PCR反应中加入10％DMSO，这可能是DMSO有变性DNA的作用。DMSO的使用对大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段是有益的，但对Taq DNA聚合酶有抑制作用，一般反应中应尽量不用DMSO。不过，在复合PCR中可以用。 2．甘油：有报道，反应中加入5％一20％寸油有助于PCR反应的复性过程，尤其对G十C含量高和二级结构多的靶序列以及扩增长片段(大于l 500bp)更适用。应注意的是，DMSO和甘油并非对所有PCR均有益，因此，是否加这些试剂应根据具体情况而定，也需要操作者的探索。 3．氯化四甲基铵（TMAC)： 在反应中加入1x10-4一1x10-5mol／L的TMAC可促进PcR，去除非特异扩增，而不抑制Taq聚合酶。 4．T4噬菌体基因32蛋白质(gp32) ：加入0.5—1ul的gp32(1nmol／L，Pharmacia) 可使Taq聚合酶对长片段DNA的扩增改善至少10倍。 (三) 石蜡油 反应中所用石蜡油质量要高，不能含抑制Taq DNA聚合酶活性的杂质。加石蜡油目的是防止反应液蒸发后引起的冷却与反应成分的改变。石蜡油的有无对反应影响较大(表 2—2)。但现在PE—Cetus公司又研制了一种新型PCR仪—9600型基因扩增PCR系统免除了加石蜡油的步骤。 石蜡油对PcR产物的影响 石蜡油 产物(Hg) cv + 2013 6％ - 405 72％ 扩增条件：100uI, 94℃，1min； 37℃, 2min,72℃min, 3min 九、PCR仪 由第一台PCR仪问世以来，已有不同加热—冷却机理的PcR仪相继诞生。不同仪器由于温控精度不同对PCR反应有一定影响，阅此，优化PcR反应时要注意不同仪器间的差别。 十、平台效应(plateau effect) “平台效应”是描述PCR后期循环产物对数积累的趋于饱和，并伴随0.3—1pmol靶序列的累积。根据反应条件和热循环，下列因素可能与平台效应有关：①dNTP和引物快速掺入底物中，浓度降低；②随产物增加，酶与模板的比例下降；②由于变性温度高(93—95℃)和温度循环，酶活力和dNTP的稳定性逐渐下降；④非特异产物或引物二聚体与反应物的竞争；⑤产物在高浓度时变性不完全，影响引物的延伸；⑧产物浓度高于10-8mol／L时，可能降低Taq聚合酶的延伸与加工能力(processivity)或引起产物链的分支迁移和引物转换；⑦酶与PCR产物的结合，使酶分子减少。 十一、忠实性 反应中dNTP浓度明显低于Km值(小于1umol／L)或某一dNTP的浓度低于其它三种的浓度时会增加错误掺入。因此，PcR反应中应使用较高浓度的dNTP，且四种dNTP浓度一样。由于Taq DNA聚合酶缺乏3’→5’ 外切酶活性，因此，不能象K1enow聚合酶那样校正错误掺入的碱基，错误掺人有利于链的终止，这是因为酶对错误终端的延伸主要依赖于Km值的差别。研究表明，酶对A—T配对的延伸速率分别比G—T，C—T和T—T错误快200，1400和2500倍。这种链终止限制了缺陷分子的扩增，而有助于保持反应的忠实性。当dNTP浓度过高(大于1mmol／L)时，会促进错配碱基的延伸。在每种dNTP浓度为10一50umol／L时，高温复性与延伸会最大程度地保持反应的忠实性。 |
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