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PCR技术操作程序和优化方法
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PCR技术操作程序和优化方法 典型的PCR操作 在此处仅列出—般PCR操作过程，具体影响因素的优化将在本章第二节讨论，每一个具体操作前都需进行必要的优化。 (一) 试剂 (1)引物根据待扩增DNA不同，引物亦不同，引物的设计见本章第三节。 (2)耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温(93—100c)， 不同耐热DNA聚合酶的特性详见本章第4节。 Perkin—E1mer—cetus公司、 N、F、Bio1ab、PharMacia公司、国内华美公司、复旦．大学和中国医学科学院友谊公司等均有商品供应。 (3)10x PCR缓冲液： 500mm01／L KCl； 100mmol／L Tris一HCl(pH8.4， 20c)， 150mmol／L MgCl2， lmg／m1明胶o ““ (4)5mmo1／L dNTP贮备液：将dATP，dCTP，dGTPT和dTTP钠盐各100mg合 并，加3m1灭菌去离子水溶解，用NaoH调pH至中性，分装每份300v1， (-) 20℃保存c dNTP浓度最好用uv吸收法精确测定。另外。现在已有中性dNTP溶液商品供应 (Sigma公司和Pharmacia公司等). (5)标本处理试剂：不同标本所需试剂不同，根据具体情况而定〔见本章第6节)G (二) 操作程序 利用PcR扩增的操作程序基本相同，只是根据引物与靶序列的不同，选择不同的反 应体系与循环参数(见本章第：：节)o基本的操作是将PcR必需反应成分加入一微量离心 管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。每个实验室或每个人都有不同的操 作习惯，但需遵守一定的操作规范。我们推荐下述操作程序，因这样操作可最大程度地增 加反应的成功率。 (1)向一微量离心管中依次加入： ddH20 补至终体积(终体积50~100ul) 10 x PCR缓冲液 1／10体积 dNTP 各200umol／L 引物 各1umol／L DNA模板 10*10一10*10*10*10*10拷贝 混匀后，离心15s使反应成分集于管底。 (2)加石蜡油50—100ul于反应液表面以防蒸发。置反应管于97c变性7min(染色体 DNA)或5min(质粒DNA). (3)冷至延伸温度时，加入1—5U Taq DNA聚合酶，在此温度作用1min. (4)于变性温度下使模板DNA变性适当时间。 (5)在复性温度下使引物与模板杂交一定时间。 (6)在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间。 (7)重复(4)一(6)步25—30次。每次即为一个PcR循环o (8)微量琼脂德凝胶电泳检查扩增产物(见本章第7节)o 上述过程可以用PcR自动热循环仪进行，也可以设定3个恒温水浴锅手工操作. |
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3楼2006-04-02 21:28:36