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liuqinggc065

新虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】荧光原位杂交实验技术已有11人参与

各位大侠，有谁做过荧光原位杂交的实验啊？本人最近要做这方面的实验，但没有做过。如果有哪位大侠做过，还请能把实验操作过程、注意事项等发来分享一下。有金币奖励哦！

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年轻人爱拼才会赢！

1楼 2010-06-23 10:00:43

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glidingwater

银虫 (小有名气)

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):哇~~貌似很全的，是原创吗？ 2010-06-24 15:08:37
lstt09nk(金币+2):鼓励原创~~欢迎多多发布此类帖子，分享实验经验~~ 2010-06-24 15:13:09

细菌细胞内核糖体数量达十万左右，核糖体RNA(rRNA)有特异区和高度保守区，
对物种的进化有指示性作用，被称为微生物体内的“活化石”。核糖体内的16S rRNA
的序列是最理想的用于基因分类的靶序列，进化过程相对独立、缓慢，其高度保守
区和高变区相间排列，从域（kingdom）到种都有特殊序列片段。  16S rRNA分子结
构上高度保守，只有某些位置有少量核苷酸序列的改变，而这些位置的改变具有种
属特异性。此外，该区信息较多，且长度适中，约1500 bp。所以根据16s rRNA序列的保守性和特异性可设计所需要的不同种属的寡核苷酸探针。所谓核酸探针是指能
识别特异核苷酸序列的带标记的一段单链DNA或RNA分子，只与被检测的特定核苷
酸序列结合，不与其他系列结合。FISH技术对微生物种群的探测使用的16(23)S
rRNA寡核苷酸探针，一般荧光标记20 bp左右的特异性核苷酸片段上，利用该探针
与固定的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交。分子杂交先是DNA双链变性为
单链，然后同源单链在退火时，碱基重新互补配对形成双链结构的过程。FISH过程
并不需要DNA或RNA的提纯、扩增等繁琐步骤，实用性较强。
1)设计原则
寡核苷酸探针是根据已知靶序列设计的，遵循如下的设计原则：(1)探针长度：
10~50 bp，越短则特异性越差，太长则延长杂交时间；(2) G+C％应在40％~60％，否则降低特异性；(3)探针不要有内部互补序列，以免形成“发夹”结构。(4)避免同一
碱基连续重复出现；(5)与非靶序列区域同源性<70％。
2)获得探针序列
有三种方法获得探针序列，一是根据已知细菌种自主设计；二是直接利用已有
的寡核苷酸数据库，例如，Loy A.，Horn M.，Wanger M．等建立的 probeBase 寡核苷酸数据库，也可利用 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)探针数据库。三是参
照文献上探针资料。

具体操作如下：

在接菌培养至相应时间时，取菌液三角瓶中矿浆培养液 1ml 于 1.5ml
ependorf  管中，13500rpm 离心 10min，弃上清，分别加 500μl×PBS 震荡混匀，13500rpm 离心 10min，弃上清，加 50μl×PBS 和 150μl 4%多聚甲醛震荡混匀，冰上固定 3h。
  固定完毕， 13500rpm 离心 10min，弃上清，分别加 500μl×PBS 震荡混匀，13500rpm 再离心 10min，弃上清，重复上述操作一次，然后分别加 50μl×PBS 和50μl 无水乙醇混匀，各取 5μl--10μl 样点到玻片上，剩余样品放入-20℃冷柜保存，留作后用。加到玻片上的样品自然风干，然后用浓度为 50 %、80 %、98 %梯度乙醇各脱水3 min，自然风干。以此同时，在 50ml 的离心管中垫上一块餐巾纸或一小块棉纱，然后用杂交缓冲液把其润湿，放入 46℃的培养箱中预热 10min。
在自然风干的样品上点加杂交液，每个样加 9μl 杂交液，其中探针 1μl，杂交缓冲液 8μl。先按样品的数量计算总的探针的量和杂交缓冲液的量，然后分别取总的探针的量和杂交缓冲液的量于 PCR 管中混合均匀，再分别吸取 9μl 点到样品上。加完杂交液后，迅速把玻片放入事先预热好的离心管中，拧好盖子，放入 46℃的培养箱中，遮蔽光线，杂交 2.5h 到 3h。
   杂交结束前 20min 左右，把洗脱液到人 50ml 的离心管中，固定在浮漂上，放
入 48℃的水浴锅中预热。待杂交结束，取出玻片，用 1ml 洗液器吸取预热的洗脱液
缓慢地把杂交液冲洗掉，然后把玻片放入预热好的洗脱离心管中，再放回 48℃的水
浴锅中洗脱 15min 左右，洗脱完后，用冷的去离子水缓慢冲洗玻片，避光自然风干，
荧光显微观察。如不能及时做荧光显微观察，可以把玻片保存在-20℃冰柜中。

  个人能力有限，仅供参考，若有误，请指教！

[ Last edited by glidingwater on 2010-6-24 at 20:31 ]