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shuoshine

新虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助】求助ACE抑制活性的测定方法已有7人参与

各位有没有做过ACE抑制活性的体外测定的，即ACE与HHL反应生成马尿酸的分光光度法测定。本人实验几次结果均不理想，现求助具体测定方法内容，越详细越好。非常感谢，祝愿大家心想事成，万事如意！

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Lxd2018

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1楼2010-06-07 10:51:18

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army888888

至尊木虫 (文坛精英)

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专业: 生物化工与食品化工

★
shuoshine(金币+1):谢谢参与

1  仪器与试剂
Agilent 1100 HPLC系统（Agilent，USA）：高压二元泵、紫外检测器、在线脱气机、自动进样器；Agilent色谱工作站，Zorbax SB-Aq色谱柱（5µm,4.6×150mm, Agilent，USA)，乙腈（色谱纯），马尿酸（色谱纯）。
2  样品预处理
取7ml待测样（豆乳或牛乳等）品置于50ml离心管，调pH至8.3，取1.8ml离心（10000g）10min，取清液，待ACE抑制率测定。
1.8ml离心管中加40ul 10mM HHL（溶于0.3M NaCl，0.1M 硼酸缓冲溶液，pH 8.3）和40ul已预处理样品混合后再加40ul 10mU/ml ACE（溶于0.3M NaCl，0.1M 硼酸缓冲溶液，pH 8.3）混合（转速约达8000转/分时停转），37℃(空气摇床，恒温水浴)反应30min，取出离心管，立即转入已准备好的85℃水浴中灭活5min后冷却、离心（转速约达8000转/分时停转）加120 ul高纯水离心混合（转速约达8000转/分时停转）后经0.45µm过滤待测马尿酸含量。
另外再做40ulHHL+40ul水+40ulACE（对照）和40ulHHL+80ul水的样品（平行3次）。
ACE抑制率按下式计算：
ACE抑制率(%) = ([HA]c –（[HA]s-[HA]b) / ([HA]c – [HA]H) × 100%
式中，[HA]c：对照样品马尿酸浓度（加缓冲液）；[HA]s：待测样品的马尿酸浓度；[HA]b ：空白样中的马尿酸浓度；[HA]H：HHL标准品中所含马尿酸浓度。
若你们测定的空白样品中没有马尿酸的话，可以不测空白样品的马奶酸含量，以便减少工作量。
3  色谱条件
流动相：0.1%TFA水溶液和0.1%TFA乙腈溶液，体积比为75∶25；流速1.5 ml/min；紫外检测波长228nm；柱温：35℃；进样量：10μl。
4  绘制工作曲线
将马尿酸标准品1.00，5.00，10.00，20.00和50.00 mg/ml系列浓度进样分析，测定相应峰面积后进行线性回归。