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wypward(金币+2):欢迎新虫，谢谢参与 2010-05-31 16:26:41
lanlan_zhu(金币+1, 翻译EPI+1): 2010-06-01 19:47:18
lanlan_zhu(金币+99): 2010-06-01 19:47:23
由于翻译的比较匆忙 会有一些有些出入的地方不太正确，请见谅 ，可供参考。
讨论
黑曲霉，是用于商业，是一个生产各种酶的分泌，目前正在作为外源酶的分泌主要开发 (Archer & Peberdy, 1997; Gouka et al., 1997a)。 尽管在丝状真菌分泌蛋白生物技术有重要性，分泌途径细节在很大程度上是未知。我们目前的知识对于蛋白质的分泌有很多来自于对温度敏感突变体分泌研究在酿酒的酵母中。鉴定同源其他几个真核生物，包括黑曲霉（Veldhuisen et al.1997） 表明该蛋白质的分泌过程是高度保守的。这是一个合理的假设，因此，在酵母蛋白分泌和丝状真菌将有许多特点。然而，这两个群体之间的生物和orphological差异表明，额外的蛋白质可能在蛋白质的分泌过程中涉及的真菌菌丝。这是突出强调了在粗糙脉孢菌膜联蛋白同源基因同源性的股票的膜联蛋白基因家族在高等真核生物，但似乎是在S缺席酵母（布朗等人最近鉴定。，1998）。
在我们的基因融合系列取代了淀粉糖化酶与sGFP结合域创造了在黑曲霉分泌过程的研究荧光标记。 其中两位是专为融合蛋白的分泌，并雇用两名糖化酶蛋白（GLA499和GLA514不同长度），虽然两者结构缺乏淀粉结合域。这种方法已成功地用于在两种情况下分泌外源蛋白。第三个构造包括一个C -末端HDEL主题，旨在保留范围内的内质网腔的融合蛋白。糖化酶中分泌融合不同长度被发现有两个GLA499没有显着的效果：GLA514：：sGFP在黑曲霉产生荧光相同的模式，并从这一独特的ER -保留GLA514：在青年表示GLA的菌丝：：sGFP融合蛋白，明亮的荧光观察显示，该融合蛋白分泌的菌丝壁，但在细胞壁保留。在细胞壁中的融合蛋白的存在证实了免疫金标记。胞外蛋白保留在菌丝壁已被报告过，葡萄糖氧化酶的黑曲霉（维特芬等。，1992年）和北路粗糙脉孢菌（特里维西克＆Metezenberg，1966年蔗糖）和一对酿酒酵母（德诺贝尔＆巴尼特，1991）分泌多种蛋白质。使用sGFP，我们能够直接观察活体细胞内的墙壁，融合蛋白的存在，将有难以完全根据西方分析。我们开发一个简单的提取方法，释放出细胞壁的融合蛋白。很可能在其中糖化酶±基因融合以往的研究已经用异源蛋白的分泌，细胞壁的定位是不承认，因为没有用萃取法之间的细胞壁和细胞内蛋白质的约束歧视(Archer & Peberdy, 1997; Gouka et al., 1997a; van den Homberg et al., 1997). 。胞外蛋白酶可能为GLA的退化：在培养上清sGFP融合蛋白，即使在豆浆中的地方被发现的sGFP退化发生在比中定义的速度较慢卵裂的GLA的：：sGFP融合蛋白似乎发生在糖化酶之间的和作为一个明显的切割分子量27 kDa的连接器sGFP sGFP地区最初（预计分子质量为完整sGFP）西方分析检测后4 d的豆浆中生长。对达到或接近糖化酶融合蛋白裂解交界处的融合已经公布了其他外源蛋白，即使在一个公认的加工点（罗伯茨等人的情况下，。，1992）进一步退化的sGFP上清液中曾表示，检出的sGFP损失金额四后六在D15中突变体，它有一个酸化能力下降的介质，能维持超过AB4.1胞壁荧光。这些数据表明，亚麻酸：：sGFP融合结构，可用于监测发酵蛋白分泌，只要持有以上，pH值pH值6 ± 0。它也可以使用GLA的：：sGFP表现的菌株筛选额外蛋白酶缺失突变体。两者合计，结果表明，在年轻的GLA的菌丝sGFP融合蛋白主要是在菌丝分泌的提示，但部分在细胞壁保留在墙壁造成荧光在较旧的菌丝体，胞壁荧光丢失作为培养液和蛋白水解酸化降解的结果，可能由acidinduced蛋白酶。图。 6。分泌发生在菌丝提示。杨萱藻幼苗对黑曲霉AB4.1 G514：：sGFP成长为（1）20 h和（二）28 Ĥ显示根尖定位和根尖下壁荧光损失。酒吧，20微米。图。 7。 （一未转基因黑曲霉）增长AB4.1（+）和G499：：sGFP（E）对豆浆中含有1％（瓦特/ v）为10 d和文化的相对荧光细胞外液从样品麦芽糊精AB4.1（U）和G499：：sGFP（海外）。 （二）免疫印迹分析（一）使用外文化反sGFP抗体从黑曲霉上清样品AB4.1 G499：sGFP生长在豆浆中4，6，8和10 d（通道1，2，3和4分别）和显示sGFP融合蛋白及（ii）利用反糖化酶（左侧面板）和文化样本反sGFP（右图）抗体滤液从黑曲霉G499：sGFP（线1）和AB4.1（后2巷4 D对豆浆中增长），表明具有最高分子量蛋白条带，是亚麻酸：：sGFP融合蛋白。 |
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