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【分享】PCR常见问题解决已有1人参与
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网上的知识很多，希望大家耐心去学习。我也是新手，这是对自己看过的帖子整理和总结，与大家共同讨论。希望高手多多指教，也希望对大家能有所帮助。 在出现PCR之前，传统的重组DNA技术是应用限制性内切核酸酶和连接酶通过切割和连接对DNA进行操作。而最通用的方法是T载体克隆。但这个方法有很多缺点，如限制酶的酶切位点有限、浓度不高（需要提很多的T载体）。PCR的出现解决了以上问题。但要把你克隆的片段连到载体上时，一般是通过在引物的两端加上酶切位点。这加的酶切位点与你选用的载体有关（下边会讲）。 PCR循环中有三种不同的事件发生：ⅰ模板变性；ⅱ引物退火；ⅲ延伸 模板变性：就是使你的DNA材料加热时发生变性变成单链。一般的加热温度是92-96度，这要视你DNA的复杂度和反应体积而定。对于用于菌为扩增材料的，一般是要预变性（一般95度5min视菌株而定但变化不会很大），然后才进入循环。 引物退火：就是使寡核苷酸引物与和它互补的单链靶序列杂交即引物和模板DNA的复性。这一步的理论是引物以远多于靶序列的数量存在，长度也短于靶序列，因而它们与互补序列的配对速度比靶序列重新配对成双链的速度快几个数量级。在这个过程中采取的温度Ta至关重要，Ta由引物与靶序列的同源性程度和寡核苷酸的碱基（可以用Tm表示）组成决定。Ta过高会使引物不能很好的与模板的复性扩增效率会很低，过低会扩增出的结果会有很多杂带。一般会比Tm低2-5度。Tm下边会专门讲。 延伸：即寡核苷酸引物的延长。对于Taq DNA聚合酶，这一步通常在72度下进行。在这一温度下，Taq DNA聚合酶的聚合速率约为2000 bp/min。 引物的设计 引物设计需要考虑的问题。 进行PCR扩增的主要目的是得到目的片段并连接到相应载体中以利于下一步的基因操作。因此引物的5’端一般都会含有额外的核苷酸，而这些核苷酸可以是限制性酶切位点序列，第二次PCR扩增的引物序列以及RNA聚合酶体外转录PCR产物的启动子序列等。而以添加限制性酶切位点序列的为多。 而如果要在5’端加入酶切位点首先要有载体图谱和双酶切反应时的Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表（http://www.takara.com.cn/?action ... d=69&subclass=1，http://www.takara.com.cn/?action ... d=67&subclass=1） 要引入的两个酶在载体上的距离不能太近，最好隔4个以上的核苷酸。而且你的目的片段中（靶基因）不能含有这两个酶的酶切位点。这两个酶不能有碱基的交叉，两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。选用的两个酶在通用缓冲液都有比较高的活性。如果可以当然还是用比较常用的一些酶了（如HindⅢ,EcoRI），比较省事的。虽然对同一个酶切位点经酶切后的黏性末端是一样的，如HindⅢ（AAGCTT）酶切后两侧的黏性末端都是AGCT。但把酶切位点加在引物的5’端后可能会导致不同的连接结果，如把AAGCTT加在上游引物的5’端和把TTCGAA加在上游引物的5’端连接在载体上会是不同结果，你的目的片段一个是在（+）链上一个是在（-）链上，这需要根据你的载体的转录方向和你目的片段的转录方向认真的添加酶切位点。另外一个就是酶切位点的保护碱基问题，现在好像还没有统一的观点是加多少个和加什么核苷酸更有效。宝生物公司在其官网中描述“结果显示，基本上所有限制酶，在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后，可以对其酶切位点进行有效切断。”而在NEB的试验中则是有好多酶需要6个以上的额外保护碱基。（需要注意的NEB的实验是寡核苷酸！！而不是末端带酶切位点的肽链！这有可能只能说明酶在作用于识别位点时所需占据的链长，并不能说明在设计酶切位点时要加那么长的保护碱基）（ http://www.neb.com/nebecomm/tech ... olignucleotides.asp）。要用酶的一定要先上网查一下的，各个酶的切割效率差别很大的，好像NdeI就不是很好切的。保护碱基还是很重要的，还是建议至少加4个保护碱基的。 引物长度 引物的长度一般控制在18-24个碱基（这仅指配对的碱基数并不包括5’端的额外添加的碱基如酶切位点、启动子等）。一般设计软件的默认值是20个碱基。这么长的寡核苷酸链对于不含序列变异的、靶位准确的标准PCR是很有用的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。长的引物能减低PCR扩增效率，这是由于熵的原因，引物越短，它退火结合到靶DNA形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越大，而引物过长这种结合速率变慢，这也是PCR引物退火的原理（双链时一个全长的单链相当于一个引物）。但引物长度的上限并不是很重要的，它主要与反应效率有关（但PCR自身的效率很高）。但作为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54度的最短引物，可获得最好的效率和特异性。如果扩增有一定程度的不均一性的序列（ATGC不是平均分布的序列），一般是设计28-35个碱基长的寡核苷酸作引物。 引物的特性 引物的3’端对扩增是否成功非常关键。引物3’端最后5到6个核苷酸尽量不要有错配，最后3位应该绝对没有错配。设计引物时最好在最后5-6个核苷中含有3个A或T，但一定避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C，T也可以。3’端不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC。在3’端尽量不要出现二聚体和发夹结构和不要错配，有的话要严格控制在3个核苷酸之内。3’端不能太稳定，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下，绝对值最好不要超过9。 在oligo评价中，对二聚体和发夹结构的要求是其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个，这是很高的要求，一般达不到，一般绝对值不超过10就可以的。如果退火温度很高的话还可以对这个值要求在放宽的。Internal stability也很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3’端不要过于稳定。 最后讲一下最重要的的参数溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。如果误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，这样设计的引物Tm会过低，可能导致PCR反应的诸多困难。所以，设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（有人喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。Tm温度高的引物就比较容易克服3’发卡、二聚体及3'非特异结合等问题引物公司给发的单子中计算的Tm包括酶切位点的（引自丁香园帖子）。 一般说来，引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度（根据互补区计算的Tm）的条件下进行4到5个扩增循环，然后再假定引物5’端序列已经加入到模板中，计算得到的退火温度（课根据引物公司给计算的Tm）下进行其余的循环。 |
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 多看多学 | QPCR实验困惑 |
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