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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】同时转3个基因
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pidou213

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】同时转3个基因 已有8人参与

我现在想同时转三个基因
思路1、将三个基因通过酶切、连接，弄到一个载体上，然后转菌；
问题：什么质粒能够多次酶切？会不会影响质粒的表达？
有没有很成熟的载体来连接两个或者两个以上的基因片段？


思路2、转化时，将三个载体（分别连着三个基因），一起转化，通过筛选标记，反推片段是否转进菌体。
问题：载体不相容的问题；这样转的概率很低；


请虫友们帮助分析，万分感谢
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见得多爱的多
1楼 2010-05-14 17:15:27
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pidou213

木虫 (正式写手)
咋就没有人回复呢？？
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见得多爱的多
2楼2010-05-14 17:47:54
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xiangao

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
scelab(金币+3):英文达人？ 2010-05-14 21:18:01
宿主菌是什么？ 第一个思路估计连上表达也很微弱（metabolic burden）,However you can chooose and construct suitable plasmid with three dinstinct expression cassette； for another question what you worried indeed exist, the most important thing is to use plasmids with compatible origins
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3楼2010-05-14 19:55:04
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
pidou213(金币+1):谢谢你哦 2010-05-14 20:39:19
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-14 21:18:15
呵呵，共表达的问题？你可以在基因的引物上加上合适的位点，切开连上三个基因即可，最后再连质粒，并不需要三次酶切质粒，如果这三个基因使用相同的启动子，那么每个基因末端的终止子要去掉，建议你coexpression为关键词找点文章参考一下，
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4楼2010-05-14 20:00:52
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pidou213

木虫 (正式写手)
酵母菌

请问还能略指点一二吗？真的很着急，你的意思是因为负担重，可能表达不出来？

载体表达的时候难道也会受到基因长度的影响吗？
引用回帖:
Originally posted by xiangao at 2010-05-14 19:55:04:
宿主菌是什么？ 第一个思路估计连上表达也很微弱（metabolic burden）,However you can chooose and construct suitable plasmid with three dinstinct expression cassette； for another question what you wor ...

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见得多爱的多
5楼2010-05-14 20:40:27
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
1949stone(金币+1): 2010-05-15 14:42:44
1949stone:谢谢交流 2010-05-15 14:42:55
载体的表达不是受基因的长度而是串联表达的时候能否在正确的位置切开，最好各个基因拥有自己的启动子和终止子，
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6楼2010-05-15 11:01:37
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick
pidou213(金币+1):谢谢回复 2010-05-15 12:03:48
我有连过两个，利用的是宿主菌的强启动子，可以表达。如果都是连到游离质粒上，分别导入三个质粒不太好吧，会导致不稳定，质粒易丢失啊~
可以先择具有合适MCS的质粒，同时连接，但要注意启动子，RBS等的设计。如果没有合适的酶切位点也没关系，设计引物的时候可以自己加入想要的。
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我们都是芸芸众生的小人物，相遇相知，都是幸福！
7楼2010-05-15 11:11:50
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-15 12:48:12
我也在酿酒中同时表达三个基因，唉，至今还是只有两个基因表达，唉，不知道是缺失了（因为三个表达框架是用的相同的启动子和终止子不知道会产生重组缺失吧）还是酶的活性低了导致底物转化率还是根本没有表达；
但是做过real-time 转录情况没有问题。。。还有什么原因，寻找中。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
8楼2010-05-15 11:45:12
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pidou213

木虫 (正式写手)
设计引物时自己加的酶切位点，如果载体自身没有的话，怎么进行转接呢？
引用回帖:
Originally posted by bettyshan at 2010-05-15 11:11:50:
我有连过两个，利用的是宿主菌的强启动子，可以表达。如果都是连到游离质粒上，分别导入三个质粒不太好吧，会导致不稳定，质粒易丢失啊~
可以先择具有合适MCS的质粒，同时连接，但要注意启动子，RBS等的设计。如 ...

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见得多爱的多
9楼2010-05-15 12:04:28
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-05-15 12:04:28:
设计引物时自己加的酶切位点，如果载体自身没有的话，怎么进行转接呢？



你可以借助其它的载体，现在其他载体上构建好了，然后酶切或者pcr，将你的目的序列再转移到你的目的载体上。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
10楼2010-05-15 12:42:09
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