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yidaqunyan

木虫 (正式写手)

博士

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[交流] 【求助/交流】请问各位老师，用蛋白酶K去除RNASE可行吗？已有3人参与

各位老师，我在网上偶然看到这一个帖子：
蛋白酶 K 的妙用，我曾经在别的论坛发表。坦率地说，蛋白酶 K 的这个用途，是我的得意之作之最。不是因为该发现有什么创新，而是因为它的实用性。当别人还在讨论 DEPC 有什么毒性，讨论那一家公司的 DEPC 好时，我早就在使用蛋白酶 K 替代 DEPC 实现灭活 RNase A 的目的了。[不过有一点还是要声明，我没有使用该方法制备的水用于溶解 RNA。原因不是在于我对该方法的担心，而是我没有制备高纯水 (Millipore 水) 的设备。与保存及酶反应有关的水，除了酶的残留是一个考虑因素外，水的纯度也是我考虑的；这种用途的水，我使用的是 Sigma 进口的无酶的 Millipore 水（也不是 DEPC 处理的水）。我的用途很特殊，首先要求最高纯度的水，所以我只能付出更大的代价。]

看这篇东西，我不知道大家的最大担心是什么；最早我的最大担心是蛋白酶 K 的”尸体“是否会对后续实验产生影响。做过的实验证明我的担心是多余的。
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蛋白酶 K，威力巨大的广谱蛋白酶，95C 加热10 分钟，则完全失活。数年前首次使用它替代 DEPC 处理 RNA 抽提用的离心管和枪头，效果不错；后来又用于处理 RNase-Free的水，效果也是一级棒。从此就再也不用 DEPC 了。现在将它的细节公开，与大家分享。

配制 RNA 裂解试剂时，直接用灭菌的双蒸水配制，最后，加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀，室温放置 15 分钟后即可。

枪头及离心管去除 RNase：先将枪头及离心管清洗干净后，移入预先混好的含 1ug/ml 蛋白酶 K 的双蒸水，彻底浸入。室温放置 30 分钟后，连水一起高压灭菌。弃水后，烘干即可。

RNase-Free 水的获得：直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀，室温放置 15 分钟后，灭菌处理即可。该蛋白质的残留对后续实验没有可见的影响。

无蛋白质残留的RNase-Free 水的获得：这比较麻烦。直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀后，倒入专用的蒸馏器中。放置 15 分钟后，加热蒸馏，流出的就是无蛋白质残留的RNase-Free 水。要提醒的是，该专用蒸馏器头几次流出来的水，只能当普通蒸馏水用，因为通道中难确保 RNase-Free 的环境；另外，一定要主要密闭性，否则，流出的水又被污染了。

我比较茫然。不知道这个帖子是不是准确的是不是可以使用的。我担心一个是效果问题，另外一个是蛋白酶K的残留问题，有些残留会不会影响到以后的实验？比如RT等等。
不知道有没有老师用过这个方法，我想请教一下~
谢谢各位老师的关注！

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