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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于酶活测定
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gliangw

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】关于酶活测定

我想测定细胞内的谷氨酸脱氢酶的活力，将细胞破碎后，离心，上清液作为粗酶液。
参考的资料上说，1 mL反应体系如下：20 mM α-酮戊二酸，20 mM NH4Cl，1 mM CaCl2，200 mM NAD(P)H及适量酶液混合后30℃下进行反应，在紫外/可见分光光度计上用石英比色皿（光程为1cm）在340 nm测定反应开始1min内的吸光度变化值。NAD(P)H的摩尔消光系数为6.22×103 L•mol-1•cm-1。酶活单位定义：1 U是指1 min产生1 μmol NAD(P)H变化所需的酶量。我有几个疑问烦请大家帮忙解决一下：
1.反应体系中除粗酶液以外的其它组分，配制时的浓度应为多少？也就是说，加入粗酶液以后，组分都被稀释了。
2.既然反应体系才1 mL，量这么少，如何用分光光度计测定啊？用比色皿怎么也得5 mL啊。如果非要稀释的话，我担心吸光度太小，不准确。
也许我的问题有点幼稚，希望各位高手不吝赐教，谢谢！
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遨游在微生物的世界里
1楼 2010-03-26 22:08:43
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你要加多少粗酶液？如果是500ul，那么底物就配成2X的，然后1：1混合就是了
1ml对于可见光比色皿来说完全足够啊~不需要充满整个皿，只需要高于光路就好了
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2楼2010-03-26 23:12:35
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