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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】Tail-PCR总是拖带，请帮忙解决！
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geling1123

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】Tail-PCR总是拖带，请帮忙解决！

大家好，我一直在用Tail-PCR的方法找Tn5的插入基因及位点。
最近做的总是拖带，跑完电泳后条带呈涂抹状。分析了如下原因：
1、基因组浓度太高，模板量稀释不够。但是后来我将模板基因组稀释到20ng,加一微升到25微升的PCR反应体系。
2、酶活性不高吗？由于Tail-PCR每一轮的循环数较多，酶活力是不是不够了？
3、每一轮的72度延伸时，我用了2min，是不是太长？

其它方面是不是没有考虑到，如果大家不反对，我将把程序发上来，请大家指导。
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1楼 2010-03-26 17:40:32
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我碰到的条带涂抹状都是因为引物降解了~
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2楼2010-03-26 17:52:06
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wwllkkhh

金虫 (小有名气)
浓度过高不可能出现严重拖带，看看酶是否保存好的，其次看看引物是否好的，其他可能性较小
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牛~逼~哄~哄
3楼2010-03-26 19:49:33
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geling1123

铜虫 (小有名气)

引物新合的

你好，谢谢你的答复。一开始我也考虑到这个问题，后来我重新合成了，还是拖带。我现在一点办法都没有
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-03-26 17:52:06:
我碰到的条带涂抹状都是因为引物降解了~

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4楼2010-03-27 18:22:20
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geling1123

铜虫 (小有名气)

酶的问题。

我用的是rtaq。有人说他们做Tail-PCR的时候，是在94度变性以后再加酶，否则循环太多的话，酶会失活，我还没有这样做过。你觉得有道理吗？
引用回帖:
Originally posted by wwllkkhh at 2010-03-26 19:49:33:
浓度过高不可能出现严重拖带，看看酶是否保存好的，其次看看引物是否好的，其他可能性较小

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5楼2010-03-27 18:24:26
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