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maria229

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】DNaseI处理后,加EDTA失活,RNA居然降解了

体外转录的样品,用的1ugDNA模板,转录后加了2U DNaseI处理,然后加10mMEDTA 65C10min ,结果RNA降解了,不知到什么原因。急求解答,万分感谢!
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献


1949stone(金币+1): 2010-03-22 11:07
估计是DNaseI被RNase污染了。
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2010-03-22 10:25:28
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maria229

木虫 (著名写手)

不是的,我DNaseI处理之后跑过电泳,没有降解,之后也是加和不加EDTA的样品同样跑的,没降解呀。
3楼2010-03-22 11:04:45
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)

★ ★
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amisking(金币+1): 2010-03-22 13:30
首先明确,RNase 不存在时金属离子时具有活性的。后加EDTA 如果污染了RNase。。。。

[ Last edited by iaminxanadu on 2010-3-22 at 11:16 ]
4楼2010-03-22 11:15:36
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maria229

木虫 (著名写手)

可是我单独做了有RNA有buffer还有EDTA时的对照,这里的RNA并没有降解呀,应该说明EDTA并没有污染RNase。而且我之前先后做了两个样品都是降解的。
5楼2010-03-22 12:29:18
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+1): 2010-03-22 18:58
楼主的实验设计的很严谨,真的看不出有什么漏洞,会不会是65摄氏度RNA受不了了,毕竟是体外转录的RNA嘛
6楼2010-03-22 13:24:11
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won7

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我有时也遇到这个问题,我一般不加EDTA终止,而是直接做反转录或再抽提后再反转录。
7楼2010-03-22 14:28:22
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骚人追月

金虫 (小有名气)


司马诸葛(金币+1): 2010-03-22 18:58
+点甲醛试试
会做饭就会做实验?
8楼2010-03-22 16:23:06
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
EDTA是RNase FREE的吗,可能是EDTA的问题
9楼2010-03-22 16:34:26
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maria229

木虫 (著名写手)

谢谢大家的回答,再问下7楼的won7  :不加EDTA失活DNaseI而直接做RT的话,DNaseI不会降解新合成的cDNA是吗?好像我记得DNaseI作用的是dsDNA,那么像RNA-cDNA杂合的双链,以及单链状态的cDNA是不能被降解的,对吗?如果是这样,我也就直接做RT好了。抽提的话,我担心损失的太多了。
10楼2010-03-22 18:47:32
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