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Niclo2008

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】PCR求助

在下要PCR 某病毒的某段基因,但是这个基因在NCBI上没有序列公布,我已根据与此基因有一定相似性的基因设计引物来扩了,但至今也未扩出,不知各位高手有何其他方法。这段基因大概长2500bp,此病毒至今未研究深入,NCBI上只有其三段基因公布。与其相似性最高的病毒相似性也只有50%左右。所以很恼火。感谢各位帮助。
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+3): 2010-03-15 17:41
对啊,相似性太低了,不可能做出来的,简并引物都没法设计啊
不过在编码区找找,看看有没有可能找到相似度高一点的区域,就是相对保守的区域,我说的是已知的那个几个病毒比对的结果,然后设计引物,看看有没有结果
如果出带,大小差别不是太大的,都切胶回收,克隆测序
如果不出带,在保守区再设计一对引物,将两组引物组合,设计巢式PCR,增加特异性,有可能会扩出来
3楼2010-03-15 17:37:14
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linzhou922

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 2010-03-15 17:41
相似性只有50%,太低了,至少也要70%才能考虑使用你上面所说的策略,核酸序列相似性只有50%,个人觉得,对你的研究来说没有什么意义,也就是说和你的病毒的基因序列不相似。
2楼2010-03-15 17:18:06
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我之前也遇到过你这种情况,只能根据其他物种和模式生物设计引物,怎么也扩不出来,扩了半年,后来看到一篇文章,公布了很多相关序列号,我在想,我之前怎么那么笨呢,不知道别人用什么手段搜到的,小日本鬼子的生物信息学比我们学的好吗。你再仔细搜搜,一年的时间会有很多新的序列会被传上去,再搜的结果可能跟一年前不一样
不知道什么是生活了,也不知道生活是什么了
4楼2010-03-15 20:38:34
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)

同一个种属的没有相关序列很正常,你就看同一个目的,不行就看同一纲的,很可能有。我就是根据同一个目的2个基因设计的引物,现在扩出了一条跟目的条带很接近的带,准备去测序了
不知道什么是生活了,也不知道生活是什么了
5楼2010-03-15 20:41:44
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