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tstsim铜虫 (初入文坛)
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【求助/交流】连接的怪事，求助
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在做敲除同源重组法。目的片断来自大肠1.2kb,成功连于T载体-pmd19t;选用的抗性基因是氯霉素1kb，成功连于T载体-pmd19t，酶切位点只有唯一的一个---Afl II,位于目的片段的中间大约600bp处。 现分别将两个质粒用afl II酶切，回收，分别得到线性的连着目的片段的载体(切点在目的片段正中)和两端是该酶切位点的氯霉素片断，用t4连接酶kit连接，转化得到转化子十来个。 经菌落pcr验证，能够分别扩出目的片段1.2kb和氯霉素的1kb而不是理论上的1.2kb+1kb=2.2Kb。提出质粒用afl II 酶切却无法切动。 本人新手，重复上述试验3次，同样结果，因此绝非小概率实践，是否是目的片段的二级结构影响了连接？实在想不通，请各位指点！多谢！ |
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