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crab1983

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请大家帮帮忙,我的TA克隆不长菌

请教大家一个问题,我将PCR产物交回收后连到T载体上(pMD18T),然后转化到JM109感受态细胞中,过夜培养但是一直不长菌,我用的就是普通的rTAG酶,不知道是什么原因就是不长菌,请大家帮帮忙!
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yang0071

木虫 (职业作家)


amisking(金币+1): 2010-02-07 12:50
最常见的原因有
感受态不好
抗生素加错

拿个质粒当阳性对照
2楼2010-02-07 11:13:42
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yangym1123

木虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5): 2010-02-07 12:50
首先考虑的是培养基没有问题吧,再次考虑的是感受态可能有问题,用质粒做个阳性对照看看,如果阳性对照没问题(满板白色单菌落一般就可以),说明链接可能有问题,不知道你的连接插入片段有多大,如果1.5K之内,pMD18-T一般没有问题,我没有用这个载体连过很大的片段,较大的片段一般用Promega的pGEM-T载体了,连接也可以用Control DNA做阳性对照,连接试剂盒没有问题,看你的插入片段的长度和浓度以及和载体的比例!·
3楼2010-02-07 12:37:54
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户

就是啊,拿对照说话。
金币是赌出来的
4楼2010-02-08 11:20:06
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luckydong1

铜虫 (小有名气)

crab1983(金币+1): 2010-04-09 14:47
首先,你带A尾的PCR产物放了多久?一般而言,带A尾的PCR产物尽可能在一两天内连接T载体,否则,A尾易脱落,导致连接失败。其次,要保证你所用的T载试剂盒有没有问题,之前你们实验室有没有人成功克隆过。第三,感受态的问题,做转化的时候用质粒做个对照,质粒记得要稀释哦
祝成功
5楼2010-02-08 14:25:53
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