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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 【求助/交流】请大家帮帮忙，我的TA克隆不长菌
汕头大学海洋科学接受调剂
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 crab1983 的 1 个金币

crab1983

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请大家帮帮忙，我的TA克隆不长菌

请教大家一个问题，我将PCR产物交回收后连到T载体上（pMD18T），然后转化到JM109感受态细胞中，过夜培养但是一直不长菌，我用的就是普通的rTAG酶，不知道是什么原因就是不长菌，请大家帮帮忙！
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1楼 2010-02-07 10:20:04
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yang0071

木虫 (职业作家)
★
amisking(金币+1): 2010-02-07 12:50
最常见的原因有
感受态不好
抗生素加错

拿个质粒当阳性对照
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2楼2010-02-07 11:13:42
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yangym1123

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5): 2010-02-07 12:50
首先考虑的是培养基没有问题吧，再次考虑的是感受态可能有问题，用质粒做个阳性对照看看，如果阳性对照没问题（满板白色单菌落一般就可以），说明链接可能有问题，不知道你的连接插入片段有多大，如果1.5K之内，pMD18-T一般没有问题，我没有用这个载体连过很大的片段，较大的片段一般用Promega的pGEM-T载体了，连接也可以用Control DNA做阳性对照，连接试剂盒没有问题，看你的插入片段的长度和浓度以及和载体的比例！·
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3楼2010-02-07 12:37:54
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
就是啊，拿对照说话。
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金币是赌出来的
4楼2010-02-08 11:20:06
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luckydong1

铜虫 (小有名气)
crab1983(金币+1): 2010-04-09 14:47
首先，你带A尾的PCR产物放了多久？一般而言，带A尾的PCR产物尽可能在一两天内连接T载体，否则，A尾易脱落，导致连接失败。其次，要保证你所用的T载试剂盒有没有问题，之前你们实验室有没有人成功克隆过。第三，感受态的问题，做转化的时候用质粒做个对照，质粒记得要稀释哦
祝成功
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5楼2010-02-08 14:25:53
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