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lipishun

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】大肠杆菌感受态制备的问题

各位大虾,我前几天做了一次感受态,使用buffer是Buffers:
Tfb-I:
30 mM KOAc; 50 mM MnCl2; 100 mM KCl; 10 mM CaCl2; 15 % (w/v) Glycerin.
Tfb-II:
10 mM Na-MOPS pH 7.0; 75 mM CaCl2; 10 mM KCl; 15 % (w/v) Glycerin.
在液氮速冻前取了100微升做转化,挺好的。可是液氮速冻后的,就一个菌落都不长。
请问我这个过程做错了什么?我应该怎么解决这个问题呢?
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挥汗如雨

至尊木虫 (职业作家)


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我们做好的感受态不进行液氮速冻,加完15%甘油直接放入-80低温冰箱保存就可以了。
人生有三样东西不可挽回:时间,机遇,还有说出去的话。
2楼2010-01-27 12:48:46
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

我觉得这不是液氮速冻的问题,还是感受态制备的问题,可能你制得的这批感受态不能用了
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2010-01-27 13:18:31
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献


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在不加抗性的板子上涂布2ul看看是不是长。
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2010-01-27 13:29:44
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


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怎么感受态buffer这么复杂,我制备细胞时只用预冷的CaCl2
5楼2010-01-27 14:01:50
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feilr

木虫 (正式写手)


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不能速冻吧,一般是呈梯度降温吧
6楼2010-01-27 15:13:51
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


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速冻应该没有问题,提倡速冻缓融
7楼2010-01-27 15:14:46
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luckydong1

铜虫 (小有名气)


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我也试过用液氮速冻,感觉比直接放入负80要好。是不是你转化的时候有失误?
8楼2010-01-28 15:00:28
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lipishun

金虫 (小有名气)

做的过程没有失误,我师弟也帮我重复了。新鲜制备的,转化效率是很高的。
液氮速冻后再用一个也长不出来。比较纳闷。
9楼2010-01-28 15:04:02
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